尾巨桉組織培養(yǎng)研究

林樺，鄧海燕，曾奇，莫曉勇

尾巨桉組織培養(yǎng)研究

林樺1，鄧海燕2，曾奇2，莫曉勇2＊

(1.中林集團(tuán)雷州林業(yè)局有限公司，廣東 湛江 524043；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

選用已經(jīng)通過無性系測定的優(yōu)良無性系單株尾巨桉M8，以其半木質(zhì)化嫩枝為外植體，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，探討不同濃度和不同種類激素的組合處理對尾巨桉M8增殖和生根效果的影響。結(jié)果表明：(1)對尾巨桉M8增殖效果的影響激素大小排序?yàn)椋?-BA>IBA>KT；綜合有效芽數(shù)、增殖系數(shù)、苗生長情況以及試劑成本選優(yōu)，確定配方G2( 6-BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1)對尾巨桉M8的增殖效果最優(yōu)，其中平均苗高為2.50 cm，增殖系數(shù)達(dá)4.49；(2)根據(jù)生根率和根的粗壯程度篩選出的對尾巨桉M8生根效果最佳的激素組合配方為YG5 配方(IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1)，生根率達(dá)87.5%，每株平均生根數(shù)3.67根，根長約0.6 ~ 1.8 cm，根一般粗壯，苗長勢好，移栽成活率達(dá)91%。因此，適用于尾巨桉M8的較優(yōu)增殖培養(yǎng)基為：改良MS + 6-BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+卡拉膠6.8 g·L-1)，pH為5.8，可實(shí)現(xiàn)苗木生長健壯，有效芽數(shù)多，高增殖系數(shù)。最優(yōu)生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS + IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 蔗糖15 g·L-1+ 卡拉膠8 g·L-1，pH為5.8，可實(shí)現(xiàn)組培苗移栽時(shí)移栽成活率高。

桉樹；組織培養(yǎng)；增殖；培養(yǎng)基；6-BA；IBA

桉樹()組培苗具有保持母體優(yōu)良性狀、繁殖系數(shù)大、生長期短等優(yōu)點(diǎn)，在種源缺少的條件下可快速滿足市場需求。因此，組織培養(yǎng)是桉樹優(yōu)良品種快速繁殖的必要途徑，對加速桉樹人工林營建、提高其產(chǎn)量和質(zhì)量有重要意義[1]。桉樹組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，隨著技術(shù)的發(fā)展，越來越多桉樹種類的快繁體系被建立[2]。不同種類的桉樹在外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)與叢芽發(fā)生、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等方面對培養(yǎng)基和激素的需求存在一定差異。本研究以優(yōu)良無性系單株尾巨桉(×)M8的半木質(zhì)化嫩枝為外植體，在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，探討16種不同濃度和不同種類激素的組合處理對尾巨桉M8增殖效果的影響，并研究9種不同濃度和不同種類激素的組合處理對其生根效果的影響，以期提高M(jìn)8組培繁殖效率，為M8組培苗的工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

以通過無性系測定的優(yōu)良無性系單株尾巨桉M8的大樹基部經(jīng)環(huán)割后萌發(fā)的枝條(生長時(shí)間1 ~ 2個(gè)月)作為外植體，采集萌條時(shí)間為春季3－4月。外植體消毒和初代培養(yǎng)后獲得的芽苗數(shù)量較少，難以充分發(fā)揮組培快繁的優(yōu)勢，需通過繼代增殖培養(yǎng)獲取大量增殖材料，用于生根。

1.2 不同激素及其濃度配比對增殖效果的影響

篩選出適合M8增殖的培養(yǎng)基、6-BA、IBA和蔗糖濃度以及適宜pH范圍后，進(jìn)一步研究不同分裂素和生長素濃度配比對M8增殖效果的影響。按照L16(43)進(jìn)行三因素、四水平的正交試驗(yàn)(表1)。將萌發(fā)長約1 cm的腋芽切下，接種到不同激素以及不同激素濃度配比的增殖培養(yǎng)基上，篩選出最適宜的增殖配方。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶8棵芽，均重復(fù)3次。每處理的基本培養(yǎng)基均為改良MS，其他添加物為蔗糖 30 g·L-1+卡拉膠6.8 g·L-1，pH為5.8。并置于光照強(qiáng)度1 500 ~ 2 000 lux、光照時(shí)間12 h·d-1、溫度為25℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。接種20 d后統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)及苗生長狀況。

表1 不同激素種類、濃度及其配比對增殖影響的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) mg·L-1

1.3 生根培養(yǎng)

待增殖芽苗長至2 cm以上時(shí)，切取1.5 ~ 2 cm的帶頂芽莖段作為生根芽，接入不同的生根培養(yǎng)基中。每處理5瓶，每瓶8棵芽，重復(fù)3次。每處理以1/2MS為基本培養(yǎng)基，其他添加物為蔗糖15g·L-1+卡拉膠 8 g·L-1，pH值為5.8。置于光照強(qiáng)度1 500 ~ 2 000 lux、光照時(shí)間12 h·d-1、溫度為25℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。25 d后觀察生根情況，統(tǒng)計(jì)根生長數(shù)據(jù)等，并記錄苗生長狀況。試驗(yàn)處理見表2.

1.4 煉苗移栽

待根長至約1 cm，移至溫室煉苗。一周后將生根苗取出，于清水中輕輕洗凈粘附在根上的培養(yǎng)基，并將苗移栽至經(jīng)高錳酸鉀消毒的基質(zhì)中，移栽后噴水覆膜以保濕保溫，兩周后進(jìn)行常規(guī)水肥管護(hù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)采用WPS 2013和SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。評價(jià)指標(biāo)如下：

增殖系數(shù)=總芽數(shù)/接種芽數(shù)

有效芽數(shù)：芽長≥1.2 cm 的芽數(shù)

生根率/%= (生根苗數(shù)/接種總數(shù))×100%

移栽成活率/%=(成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù))×100%

表2 不同濃度配比的 IBA 和 NAA 的生根試驗(yàn) mg·L-1

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素及其濃度配比對增殖效果的影響

植物生長時(shí)通常需要多種激素共同發(fā)揮作用，想要同時(shí)獲得高生長和增殖，不僅需要調(diào)節(jié)某單一激素的含量，更需要調(diào)節(jié)激素間的含量配比，以得到最佳激素種類和濃度的配比。

由表3可知，不同激素濃度配比處理的每瓶苗高均值、每瓶有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)的值分別為18.808、30.678和56.054，均為<0.01，表明不同處理間的苗高、有效芽數(shù)以及增殖系數(shù)均存在極顯著差異。

對苗高和每瓶有效芽數(shù)影響顯著的激素有IBA和6-BA，對增殖系數(shù)均有顯著影響的激素是KT和6-BA(表4)。

表3 不同處理對增殖效果的單因素方差分析

注：“**”表示<0.01，“*”表示<0.05，下同。

表4 不同激素種類及其配比對增殖效果的多因素方差分析

由表5可知，在6-BA濃度為1.0 mg·L-1的G4、G6、G9、G15處理中，其苗高、有效芽數(shù)和增殖系數(shù)均最低，與其他處理相比其葉色淺、葉間距小、葉片不夠舒展、苗長勢一般，可見高濃度的6-BA不適宜M8的增殖；當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，在IBA濃度為0.05 ~ 0.5 mg·L-1的范圍內(nèi)，苗高隨著IBA濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，說明IBA對苗高有一定影響；當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，KT濃度變化對有效芽數(shù)及增殖系數(shù)的影響變化不明顯，在添加了KT的處理中，G8和G13表現(xiàn)最好，苗高均約2 cm，有效芽數(shù)約30棵·瓶-1；當(dāng)KT濃度一定時(shí)，6-BA在0.1 ~ 1.0 mg·L-1范圍內(nèi)，其增殖系數(shù)和有效芽數(shù)是呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)6-BA濃度超過0.5 mg·L-1時(shí)會產(chǎn)生愈傷組織；低濃度的6-BA有利于M8的增殖，當(dāng)6-BA濃度在0.1 ~ 0.2 mg·L-1，其增殖系數(shù)均超過3；在未添加KT的G1、G2、G3、G4處理中，表現(xiàn)最好為G2，該處理的苗高、有效芽數(shù)和增殖系數(shù)分別為2.5 cm、30.53棵·瓶-1和4.49，是所有處理中最高的，并與其他處理存在顯著差異；添加了KT的處理G13其有效芽數(shù)和增殖系數(shù)分別為29.20棵·瓶-1和4.01，表現(xiàn)良好，但苗高為1.96 cm，較G2的稍低。

表5 不同激素種類及其配比對增殖效果的影響

由表6可知，不同激素對有效芽數(shù)和增殖系數(shù)影響也不同。6-BA對M8的有效芽數(shù)最明顯，極差值為11.62，其次為IBA(2.38)和KT(1.29)；6-BA對增殖系數(shù)的影響最顯著，極差值為1.37，其次為KT(0.29)和IBA(0.16)；生長素IBA對M8增殖影響很小，因?yàn)樯L素一般是促進(jìn)苗高生長，同時(shí)協(xié)同細(xì)胞分裂素促進(jìn)繼代苗增殖。

對苗高影響顯著的激素中，6-BA>IBA；對每瓶有效芽數(shù)影響顯著的激素中，6-BA>IBA；對增殖系數(shù)有顯著影響的激素中，6-BA>KT，由此可見不同激素對尾巨桉M8增殖效果的影響依次為：6-BA>IBA>KT。綜合有效芽數(shù)、增殖系數(shù)、苗生長情況及試劑成本，確定配方G2(6-BA 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1)對尾巨桉M8的增殖效果最優(yōu)。

2.2 生根培養(yǎng)

一般而言，芽苗在不添加任何激素的培養(yǎng)基上也可生根，但為使植株能夠快速生根獲得成苗，需在培養(yǎng)基內(nèi)添加一定比例的激素進(jìn)行生根誘導(dǎo)。將長勢良好的頂芽截取約1 cm、接種至生根培養(yǎng)基中，10 d左右開始長根，15 ~ 20 d為出根高峰期，20 d 后大部分根長齊。不同激素濃度配比對生根的影響試驗(yàn)結(jié)果見表7 ~ 10。

表6 增殖正交試驗(yàn)極差分析與Duncan多重比較

注：同列數(shù)據(jù)后大寫字母表示<0.01，小寫字母表示<0.05，下同。

表7 不同處理對生根效果的單因素方差分析

由表7可知，不同激素濃度配比處理的生根率和生根條數(shù)的值分別為12.812、8.52(<0.01)，表明不同處理間的生根率和生根條數(shù)均存在極顯著差異。由表8可知，生根率和生根條數(shù)在不同的IBA濃度、NAA濃度下差異均顯著。

表8 不同激素種類及其配比對生根效果的多因素方差分析

表9 不同激素種類及其配比對生根效果的影響

表10 生根試驗(yàn)極差分析與Duncan多重比較

從表9可知，當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，在IBA濃度范圍為0.2 ~ 1.0 mg·L-1內(nèi)，生根率隨著IBA濃度升高而呈先升高后降低的趨勢，生根率增加，根的條數(shù)先增加后減少，根的粗壯程度增加，出根整齊，其中表現(xiàn)最好的為YG5，生根率高達(dá)87.5%，根粗細(xì)適宜，出根整齊，長勢好。IBA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，YG1、YG2、YG3的生根率為50% ~ 70%，根的粗細(xì)程度偏細(xì)，出根不整齊，根長度較短。IBA濃度為1.0 mg·L-1，NAA濃度為0.05 mg·L-1的YG7處理的生根率達(dá)80%，但該處理長出的均為須根且很細(xì)，不適宜移栽；NAA濃度為0.1 mg·L-1(YG8)，其生根率亦接近80%，根的粗細(xì)一般，長度稍短一些，苗的長勢不好且有落葉現(xiàn)象；NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)(YG9)，其生根率最低(40%)，出根不整齊、葉片脫落、長勢差。

極差分析結(jié)果可知(表10)，NAA對苗的生根率影響大于IBA，極差值分別為54.17和43.33，NAA在濃度為0.05 ~ 0.1 mg·L-1時(shí)其生根率大于濃度為0.2 mg·L-1時(shí)的生根率。通過比較均值和生長狀況可知，生根效果最佳的激素組合配方為IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1(YG5)。

2.3 煉苗移栽

將試驗(yàn)所得的生根苗移至溫室中煉苗1周后，移植到混合基質(zhì)(泥炭：珍珠巖：蛭石=3:1:1)中，移栽后第3天用0.1%的甲基托布津溶液噴施葉面，移栽后前半月保溫保濕，20 d后統(tǒng)計(jì)成活率，達(dá)91%。

3 結(jié)論與討論

3.1 增殖培養(yǎng)

苗的增殖是組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)，只有在增殖培養(yǎng)階段獲得較高的增殖系數(shù)和有效芽數(shù)，才可為后續(xù)生根出苗等奠定基礎(chǔ)，才可體現(xiàn)出組培作為快速繁殖手段的優(yōu)勢。一般而言，影響組培材料增殖系數(shù)的因子主要是培養(yǎng)基、附加成分及其共同作用。培養(yǎng)基不同激素濃度以及不同的組合對組培材料的作用效果不同。在植物組織培養(yǎng)過程中，細(xì)胞分裂素6-BA具有誘導(dǎo)愈傷組織形成、促進(jìn)芽的形成和促進(jìn)組織分化等功能。激動(dòng)素KT可誘導(dǎo)離體組織的細(xì)胞分裂和調(diào)節(jié)分化。生長素IBA在植物組培中一般用于促進(jìn)苗高生長和誘導(dǎo)根的萌發(fā)，其對M8增殖與生長均有一定影響，適宜的濃度可促進(jìn)苗的增殖與生長，濃度過高或過低則會對增殖產(chǎn)生一定的抑制作用。本研究的結(jié)果表明：對尾巨桉M8增殖效果產(chǎn)生影響的激素作用大小為：6-BA>IBA>KT，適用于尾巨桉M8的較優(yōu)增殖培養(yǎng)基為：改良MS+ 6-BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ 30 g·L-1蔗糖 + 6.8 g·L-1卡拉膠)，pH為5.8。

3.2 生根培養(yǎng)

生根率及根的粗壯程度是評價(jià)組培苗生根效果的重要指標(biāo)。尾巨桉M8最優(yōu)生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS + IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ 蔗糖 15 g·L-1+ 卡拉膠 8 g·L-1，生根率達(dá)87.5%，根一般粗壯，苗長勢好，適合移栽。生根培養(yǎng)時(shí)間不宜超過一個(gè)月，否則移栽時(shí)會因苗齡過大，不易適應(yīng)外界環(huán)境而降低移栽成活率。

3.3 移栽

本試驗(yàn)移栽選用基質(zhì)為混合基質(zhì)(泥炭：珍珠巖：蛭石=3:1:1)，移栽時(shí)間為春季，瓶苗移栽至基質(zhì)的半個(gè)月內(nèi)要進(jìn)行噴霧和覆膜，保溫且保持相對濕度在90%左右，注意預(yù)防病害，移栽成活率為91%。

[1] 江海濤.桉樹組培快繁研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J].現(xiàn)代物業(yè)(上旬刊),2012,11(7):64-67.

[2] 謝耀堅(jiān).桉樹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].世界林業(yè)研究,2000(6):14-19.

Study on Tissue Culture ofa ×

LIN Hua1, DENG Haiyan2, ZENG Qi2, MO Xiaoyong2

(1.524043,,; 2.,510642,,)

In order to examine effects of different hormones at different concentrations on proliferation and rooting of shoots of×clone M8 in tissue culture, semi-lignified shootswere used as explants and effects were studied in an orthogonal design trial. The results showed that the order of the hormones affecting M8 shoot proliferation was: BA > IBA > KT. The formula G2 (BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1) created optimal proliferation effects as judged by effective number of buds, multiplication factor, seedling growth and reagent costs. With this G2 formula the average shoot height was 2.50 cm and the multiplication factor was 4.49. Meanwhile, formula YG5 (IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1) was selected as the optimal hormone formula for M8 when judged by rooting rate and root strength. With this latter formula the rooting rate reached 87.5%, the average number of roots per plant was 3.67, root length was in the range 0.6 ~ 1.8 cm while roots were generally strong, seedlings grew well and transplant survival rate was 91%. From this study the optimal culture medium for M8 shoot production proved to be modified MS + BA 0.2 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1+ sucrose 30 g·L-1+ carrageenan 6.8 g·L-1with a pH of 5.8; this formula provided robust seedlings with a large number of effective shoots and a high proliferation coefficient. The optimal rooting medium was ?MS + IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ sucrose 15 g·L-1+ carrageenan 8 g·L-1with a pH of 5.8, and this provided for high survival of tissue cultured seedlings.

; tissue culture; proliferation; culture medium; 6-BA; IBA

S722.3+7

A

10.13987/j.cnki.askj.2020.02.06

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目“基于林相改造的桉樹人工林質(zhì)量精準(zhǔn)提升技術(shù)”(2018KJCX028)

林樺(1973－ )，女，工程師，主要從事森林培育及職工技能培訓(xùn)，E-mail: 529475315@qq.com

莫曉勇(1962－ )，男，博士，教授，主要從事森林培育和森林經(jīng)理研究，E-mail: motree@163.com