巴戟天提取物聯(lián)合GABA/茶氨酸改善小鼠睡眠作用的研究

周月,劉歡

（天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，天津300070）

我國(guó)茶葉資源豐富，但利用率較低，每年有大量中低檔、春秋茶被廢棄，而茶葉中含有的多種功能成分有較高的利用價(jià)值，其中γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）和L-茶氨酸（L-Theanine）對(duì)于睡眠有一定的改善作用。GABA是一個(gè)四碳非蛋白氨基酸，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，具有提神安寧以及提高睡眠質(zhì)量和記憶力的作用［1］。GABA 在食品及醫(yī)藥等方面已得到廣泛應(yīng)用，毒性評(píng)估支持其安全使用和作為功能性食品成分的潛在用途［2］。茶氨酸是茶葉中重要的非必需酰胺類生物活性氨基酸之一，在茶樹新鮮重量中的平均含量在1.2～6.2 mg/g［3］，具有維持正常睡眠、改善記憶功能、消除神經(jīng)毒素的作用，在緩解壓力、緩解疲勞方面也具有一定的作用［4-5］，而作用可能會(huì)有助于身心疲勞的恢復(fù)從而改善睡眠。有研究發(fā)現(xiàn)GABA 和L-茶氨酸混合物對(duì)睡眠質(zhì)量和持續(xù)時(shí)間具有積極的協(xié)同作用［6］。中藥巴戟天（Morinda officinalis）為茜草科多年生藤植物，具有抗疲勞的作用［7］，其改善睡眠的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察GABA/茶氨酸聯(lián)合干預(yù)以及添加巴戟天提取物后對(duì)小鼠睡眠的影響，探討中藥聯(lián)合茶葉中活性成分對(duì)睡眠的改善作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 健康ICR 種小鼠，單一雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006 號(hào)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。基礎(chǔ)飼料由北京阜康生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 藥品與試劑 GABA/茶氨酸、巴戟天/GABA/茶氨酸混合物均為粉末狀（實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水溶解配置），其中GABA、茶氨酸符合新食品原料要求，GABA 純度95%，茶氨酸純度是20%；巴戟天提取物采用水提工藝，購(gòu)自廣東青云山藥業(yè)有限公司；戊巴比妥鈉，進(jìn)口分裝，Sigma-Aldrich 提供；巴比妥鈉，分析純，成都西亞化工股份有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 240 只小鼠按體質(zhì)量分層后，隨機(jī)分為5 個(gè)干預(yù)組，即對(duì)照組、GABA/茶氨酸低劑量組、GABA/茶氨酸高劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸低劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組。對(duì)照組給予蒸餾水；GABA/茶氨酸低劑量組（GABA15 mg+茶氨酸33 mg）/（kg·d）；GABA/茶氨酸高劑量組（GABA45mg+茶氨酸100 mg）/（kg·d）；巴戟天/GABA/茶氨酸低劑量組（巴戟天提取物250mg+GABA15mg+茶氨酸33 mg）/（kg·d），巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組（巴戟天提取物250 mg+GABA45 mg+茶氨酸100 mg）/（kg·d）。均為灌胃干預(yù)，干預(yù)時(shí)間30 d。

各干預(yù)組中的小鼠再隨機(jī)分為4 組，分別進(jìn)行直接睡眠實(shí)驗(yàn)，延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)，每組12 只。

1.2.2 直接睡眠實(shí)驗(yàn) 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，各組小鼠連續(xù)灌胃30 d，最后一天結(jié)束直接觀察小鼠睡眠情況。以翻正反射消失為睡眠（提起小鼠尾巴，將小鼠腹部朝上放置，超過60 s 不能翻正者即認(rèn)為翻正反射消失，進(jìn)入睡眠），以翻正反射恢復(fù)為覺醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時(shí)間為小鼠睡眠時(shí)間，記錄入睡小鼠只數(shù)及睡眠時(shí)間。

1.2.3 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn) 末次灌胃15 min 后腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg·bw（此劑量為預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的使小鼠100%入睡，但又不使睡眠時(shí)間過長(zhǎng)的戊巴比妥鈉劑量），注射量為0.2 ml/20 g，以翻正反射消失為指標(biāo)，記錄戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。

1.2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn) 末次灌胃15 min 后腹腔注射戊巴比妥鈉28 mg/kg（此劑量為預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的戊巴比妥鈉閾下催眠劑量，即80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉最大閾下劑量），注射量為0.2 ml/20 g，以翻正反射消失1 min 以上為入睡標(biāo)準(zhǔn)，記錄30 min 內(nèi)各組入睡的小鼠只數(shù)。

1.2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn) 末次灌胃20 min后腹腔注射巴比妥鈉260 mg/kg(此劑量為預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的使動(dòng)物100%入睡，但又不使睡眠時(shí)間過長(zhǎng)的巴比妥鈉劑量），注射量為0.2 ml/20 g，以翻正反射消失為指標(biāo)，腹腔注射完成到翻正反射消失的這段時(shí)間為睡眠潛伏期，記錄各組小鼠睡眠潛伏期。

1.3 結(jié)果判定 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)、巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)3 項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中兩項(xiàng)陽性，且無明顯直接睡眠作用，可判定具有改善睡眠功能作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析或卡方檢驗(yàn)。睡眠時(shí)間及其睡眠潛伏時(shí)間采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。入睡只數(shù)采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較各組睡眠發(fā)生率是否相等。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直接睡眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果 GABA/茶氨酸劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸劑量組灌胃后均未直接出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象，表明本實(shí)驗(yàn)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件下兩種混合物均無直接睡眠作用，見表1。

表1 各干預(yù)物對(duì)小鼠直接睡眠的影響Tab 1 Effects of tested drugs on sleep-induced directly in mice

2.2 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)單因素方差分析，GABA/茶氨酸高劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸兩個(gè)劑量組的睡眠時(shí)間與對(duì)照組的睡眠時(shí)間比較顯著延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），同時(shí)巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組睡眠時(shí)間比其低劑量組延長(zhǎng)（P＜0.05），也明顯長(zhǎng)于GABA/茶氨酸高劑量組（P＜0.05）。GABA/茶氨酸低劑量組的睡眠時(shí)間與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明兩種混合物均能延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時(shí)間，但巴戟天/GABA/茶氨酸的聯(lián)合作用優(yōu)于GABA/茶氨酸，見表2。

表2 各干預(yù)物對(duì)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響(±s)Tab 2 Effects of tested drugs on pentobarbital sodium -induced sleep in mice(±s)

表2 各干預(yù)物對(duì)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響(±s)Tab 2 Effects of tested drugs on pentobarbital sodium -induced sleep in mice(±s)

注：與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組比較：#P＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)/只入睡動(dòng)物數(shù)/只 睡眠時(shí)間/min對(duì)照組 12 12 87.08±9.56 GABA/茶氨酸低劑量組 12 12 99.42±13.65 GABA/茶氨酸高劑量組 12 12 117.10±30.52*#巴戟天/GABA/茶氨酸低劑量組 12 12 123.25±25.91*巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組 12 12 161.50±17.76*

2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過多個(gè)樣本率的卡方檢驗(yàn)，各組與對(duì)照組之間比較睡眠發(fā)生率增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），尚不能認(rèn)為各干預(yù)物可提高閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠的睡眠率，見表3。

2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)單因素方差分析，GABA/茶氨酸高劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸兩個(gè)劑量組與正常對(duì)照組之間的睡眠潛伏時(shí)間比較顯著縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組的睡眠潛伏時(shí)間比其低劑量組縮短（P＜0.05），表現(xiàn)出一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，同時(shí)該組睡眠潛伏時(shí)間也短于GABA/茶氨酸高劑量（P＜0.05），說明巴戟天/GABA/茶氨酸縮短巴比妥鈉誘導(dǎo)的ICR 小鼠睡眠潛伏期的作用優(yōu)于GABA/茶氨酸，見表4。

表4 各干預(yù)物對(duì)戊巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響(±s)Tab 4 Effects of tested drugs on sodium barbital -induced sleep in mice(±s)

注：與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組比較：#P＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)/只入睡動(dòng)物數(shù)/只 睡眠潛伏期/min對(duì)照組 12 12 36.42±4.71 GABA/茶氨酸低劑量組 12 12 35.54±5.96 GABA/茶氨酸高劑量組 12 12 29.51±5.19*#巴戟天/GABA/茶氨酸低劑量組 12 12 29.58±5.52*#巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組 12 12 22.67±3.55**

3 討論

失眠是指持續(xù)的睡眠質(zhì)或量令人不滿意的狀態(tài)，嚴(yán)重者甚至影響白天社會(huì)功能［8］。正常的睡眠除了可以消除疲勞，使人產(chǎn)生新的活力外，還與提高免疫力、抵抗疾病的能力有著密切的關(guān)系［9］。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們的生活及其精神壓力增大，失眠現(xiàn)象日趨增多，嚴(yán)重影響著人們的精神狀態(tài)甚至身體健康從而降低生活質(zhì)量、學(xué)習(xí)或工作效率。

GABA 和茶氨酸均為茶葉中的功能性成分，已有研究發(fā)現(xiàn)GABA 和茶氨酸聯(lián)合對(duì)睡眠的積極作用。巴戟天作為具有抗抑郁作用的中藥，已被批準(zhǔn)可用于保健食品。觀察三者聯(lián)合干預(yù)對(duì)小鼠睡眠的影響，可為探討中藥聯(lián)合食品功能性成分的保健作用提供科學(xué)依據(jù)。

目前筆者檢索到的GABA 改善小鼠睡眠作用的最低作用劑量為100 mg/kg［10］；茶氨酸改善小鼠睡眠作用的最低作用劑量為100 mg/kg［11］。本研究中GABA/茶氨酸的干預(yù)劑量均低于100 mg/kg，其中高劑量組灌胃劑量為（GABA45 mg+茶氨酸100 mg）/（kg·d），而根據(jù)原材料純度換算GABA 和茶氨酸實(shí)際含量為（42.75 mg 和20 mg/kg）/（kg·d），此干預(yù)劑量即可延長(zhǎng)小鼠睡眠時(shí)間并縮短睡眠潛伏期，說明兩者具有聯(lián)合改善小鼠睡眠的作用。而如果干預(yù)制劑中添加巴戟天提取物，GABA 和茶氨酸在實(shí)際含量分別為14.25 mg/kg 和6.7 mg/kg下，即表現(xiàn)出改善睡眠的作用。巴戟天/GABA/茶氨酸三者聯(lián)合也具有劑量反應(yīng)關(guān)系，隨著劑量增高，改善睡眠的作用也更加明顯。在GABA/茶氨酸劑量相同的條件下，巴戟天提取物的添加表現(xiàn)出了協(xié)同增效作用。

GABA 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，直接參與睡眠-覺醒過程的調(diào)節(jié)［12］?？梢砸种艻CR 小鼠的活動(dòng)，減少能量的消耗，促進(jìn)睡眠。GABA作用的減弱會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿釋放增加，促進(jìn)快速眼動(dòng)睡眠［13］。某些研究中可以影響5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和多巴胺（dopamine，DA）的濃度［14］。GABA 特征的重復(fù)超低頻磁場(chǎng)的連續(xù)多次經(jīng)顱刺激可以興奮正常大鼠腦內(nèi)的GABA、5-HT 與DA［15］。茶氨酸經(jīng)腸道吸收以后，可以越過血腦屏障，增加腦內(nèi)GABA、5-HT 和DA 的濃度［16］。在抗抑郁研究中巴戟天提取物可提高抑郁患者體內(nèi)5-HT、DA含量［17］。5-HT 和DA 是參與機(jī)體睡眠-覺醒過程重要的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，其中5-HT 調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期，延長(zhǎng)非快速眼動(dòng)睡眠，從而抑制覺醒，增加深度睡眠并縮短入眠期和淺睡期。DA 具有維持覺醒和行為興奮的作用，正常含量下可減少覺醒次數(shù)，保證睡眠的完整度［18］。因此推測(cè)GABA、茶氨酸和巴戟天提取物改善睡眠的作用與改變體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。