依托咪酯膠束溶液的制備及體內麻醉效果*

吳愛玲，王瀅瑩，劉浩

(1.四川省內江市第一人民醫(yī)院麻醉科，內江 641000；2.西南醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學藥學院，瀘州 646000)

依托咪酯(etomidate)是一種快速催眠性麻醉藥，相比于丙泊酚、咪達唑侖等其他多種靜脈麻醉藥物，其對人體循環(huán)和呼吸系統(tǒng)的影響較小[1-3]，且安全劑量范圍更寬[4-5]，尤其適用于老年、高血壓、冠心病及休克患者。但依托咪酯水溶性差，不宜直接靜脈注射，限制了其臨床應用。另外，依托咪酯能與11β-羥化酶緊密結合，可抑制腎上腺皮質激素生物合成[6-7]。因此，臨床不推薦長時間持續(xù)輸注依托咪酯以維持麻醉。與其他全身麻醉藥相比，該藥主要用于單次靜脈注射麻醉誘導。依托咪酯是一種水溶性較差的酯類小分子藥物，不宜直接用于注射。此外，存在于腦微血管內皮細胞膜上的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)可能抑制依托咪酯從血液到腦內的轉運，從而影響依托咪酯發(fā)揮藥效[8]。

目前臨床使用的依托咪酯丙二醇溶劑注射液和脂肪乳注射液主要解決了該藥物的難溶性問題。但丙二醇可引起一系列不良反應，如注射疼痛、乳酸性酸中毒和血栓性靜脈炎等[9]。脂肪乳注射液雖不使用丙二醇，并且對機體刺激更小[10]，但筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，其對藥物的釋放緩慢，不利于全麻藥物所要求的快速起效和快速恢復[11]。因此，提高依托咪酯水溶性并實現(xiàn)藥物快速起效和快速恢復是一個重要的課題。

近年來，基于脂質體和聚合物膠束等的納米制劑已被積極地用于改善疏水性藥物的水溶性。這些納米載體在水性溶液中具有良好的分散性，并可能實現(xiàn)選擇性的藥物生物分布和控制藥物釋放，從而提高藥效并減少藥物副作用[12]。因此，使用適當?shù)募{米載體包封依托咪酯可能是解決該藥物問題的方法。但截止目前，僅極少數(shù)納米載體可以很好地滿足全身麻醉藥的要求，因為親水性配方由于其親水性和不合適的尺寸而經常遇到穿透血-腦屏障 (blood-brain barrier，BBB)的問題[11]。一般來說，依托咪酯的理想納米載體不僅能夠對藥物增溶，而且應具有良好的生物相容性，能夠促進依托咪酯通過BBB，并能以適當速率釋放藥物。筆者在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，由普郎尼克(Pluronic?)形成的膠束可能是依托咪酯遞送的良好載體?；谄绽赡峥说募{米載體長期以來一直被用于各種抗癌藥物的增溶和靶向遞送[13]，近年來，使用不同種類普郎尼克來遞送中樞神經系統(tǒng) (central nervous system，CNS)藥物的試驗取得了很好效果[14-15]。據(jù)報道，普郎尼克能夠抑制大腦P-gp和多藥耐藥蛋白(multidrug resistance-associated proteins，MRPs)等藥物外排轉運蛋白[16]。這種抑制作用可能是普郎尼克通過促使血腦屏障上膜流態(tài)化(抑制P-gp的ATP酶活性)和能源耗竭(降低可供P-gp和MRPs運用的ATP)這兩方面實現(xiàn)的[17]。因此，用普郎尼克膠束包封依托咪酯可能是增強藥物向腦內遞送的一種行之有效的方法，同時還可以減輕該藥物不良反應。

筆者在本研究制備一種依托咪酯普郎尼克膠束溶液(EtoPM)，并研究其對大鼠的鎮(zhèn)靜作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器 Nano ZS粒度儀(英國Malvern公司)；XR205SM-DR微量電子天平(瑞士Precisa公司，感量：0.01 mg)；H-7500透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；Exceed-Cb-20超純水機(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)；CJ-882A磁力攪拌器(蘇州金怡儀器科技有限公司)；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；YRE-2000旋轉蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責任公司)；ZRS-8GD智能溶出試驗儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；A390紫外可見分光光度計(上海翱藝儀器有限公司)。

1.2試藥 依托咪酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量≥98%，批號：D1706033)；依托咪酯乳狀注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號：20180724)；普郎尼克F68(平均分子質量8400 Da，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：J1625069)；磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉(無錫市傲銳東源生物科技有限公司，批號：WK173327-1)。

1.3實驗動物與分組 SD大鼠，無特定病原體(SPF)級，體質量(250±20) g，40只，雌雄各半，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(川)2018-017，實驗動物使用合格證號：SYXK(川)2018-065。將雌雄大鼠各采用隨機數(shù)字表法隨機分配入EtoPM組和依托咪酯乳狀注射液組，每組20只。

1.4方法

1.4.1依托咪酯膠束溶液的制備 采用薄膜水化法[18-19]制備依托咪酯膠束溶液。稱取依托咪酯晶體10 mg，普郎尼克F68 240 mg，共同溶解于三氯甲烷2 mL。將所得溶液注入50 mL圓底燒瓶，利用旋轉蒸發(fā)儀除去有機溶劑，于燒瓶內壁形成混合物薄膜。在形成薄膜的圓底燒瓶中加入PBS(pH值7.3) 10 mL，適當振蕩并以超聲(200 W)促溶，使薄膜完全溶解，形成膠束增溶的依托咪酯溶液，再將各樣品溶液以孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，即得無色澄清EtoPM溶液。

1.4.2載依托咪酯膠束粒徑和Zeta電位的檢測 將EtoPM溶液樣品稀釋2倍后，粒度儀測定膠束粒徑分布和Zeta電位，相同實驗條件下重復3次。

1.4.3載依托咪酯膠束的形態(tài)觀察 利用透射電子顯微鏡 (transmission electron microscope，TEM)觀察膠束顆粒形態(tài)。將EtoPM膠束溶液稀釋5倍后，滴于鍍有碳膜的銅網上，待自然干燥后，通過TEM觀察，記錄圖像。

1.4.4依托咪酯標準曲線的繪制 精密稱取不同質量依托咪酯，置25 mL量瓶，用PBS (pH值7.3)定容，得到5，10，15，20，30和40 mg·L-1依托咪酯溶液。以PBS (pH值7.3)作為參比，通過全波長掃描得依托咪酯于243 nm波長處有最大吸收峰，因此將波長固定在243 nm處，測量各濃度樣品溶液在該波長下的吸光度(A)。通過線性回歸，得到A值相對于依托咪酯濃度(C)的標準曲線方程。

1.4.5膠束載藥量與包裹率檢測 采用離心超濾法，取新制的EtoPM膠束溶液4 mL于離心過濾管(截留分子量3000 Da)中，3500 r·min-1(r=7.5 cm)離心5 min。將濾液吸出，并以PBS (pH值7.3)稀釋適當倍數(shù)后測定其在243 nm波長下吸光度，并根據(jù)標準曲線計算出游離藥物的濃度，從而得到包裹的藥量，相同實驗條件下重復3次。根據(jù)以下公式計算載藥量與包裹率：載藥量(%) = 包裹藥量/(包裹藥量+投入載體材料量) × 100%；包裹率(%)=包裹藥量/投入總藥量×100%。由于離心過程可能對膠束包裹率造成不利影響，另以加壓超濾法驗證膠束載藥量與包裹率。取新制的EtoPM膠束溶液10 mL于Amicon超濾杯(Millipore 8050型，配截留分子量3000 Da超濾膜)中，以杯蓋封口后，從杯蓋上方氣孔通入氮氣加壓(保持氣壓在約500 kPa)。取濾液1 mL，并以PBS稀釋適當倍數(shù)后，按照上述方法檢測游離藥物濃度。相同實驗條件下重復3次，并按照上述公式計算載藥量與包裹率。

1.4.6體外藥物釋放行為 透析法考察樣品中依托咪酯釋放速度。將適量EtoPM樣品溶液或依托咪酯乳狀注射液(各含依托咪酯10 mg)以PBS (pH值7.3)稀釋至等體積后注入纖維素透析袋(截留分子量為2500 Da)中密封好。置于37 ℃恒溫水浴溶出儀，以PBS (pH值7.3)為釋放介質，100 r·min-1攪拌。于0.25，0.5，1，2，3和4 h，分別取透析外液2 mL，同時補充新鮮釋放介質2 mL。測定透析外液在243 nm波長下吸光度，并根據(jù)標準曲線計算釋放出透析袋的累積藥量，進而得到各時間點藥物釋放百分比，相同實驗條件下重復3次。

1.4.7動物實驗 通過大鼠翻正反射實驗評價依托咪酯膠束溶液體內麻醉效果[20-21]。取“1.3”項下兩組大鼠，分別通過尾靜脈一次性注射EtoPM溶液或市售依托咪酯乳狀注射劑(以藥物計，2.85 mg·kg-1)麻醉，10 s內注射完畢，并迅速置于仰臥位，以注射完畢到大鼠前爪翻正反射消失時間為起效時間。以前爪翻正反射消失到前爪翻正反射恢復時間為自然蘇醒時間。

2 結果

2.1EtoPM膠束粒徑、形態(tài)與Zeta電位 粒度儀檢測結果表明，EtoPM膠束平均粒徑 (85.53±10.25) nm(圖1)，Zeta電位(-4.31±1.04) mV。透射電鏡圖像(圖2)顯示，載依托咪酯膠束成形良好，外觀形態(tài)圓整，粒徑大小較均勻。

2.2依托咪酯標準曲線 根據(jù)各濃度樣品溶液在波長243 nm下A值，通過線性回歸，得A值相對于依托咪酯濃度(C)的標準曲線方程：A=0.045 9C+0.005 0(r2=0.999 9)。結果依托咪酯濃度在5～40 mg·L-1內與C線性關系良好。

圖1 EtoPM膠束粒徑分布圖

圖2 EtoPM膠束透射電鏡圖像

2.3EtoPM膠束載藥量與包裹率 采用離心超濾法所得膠束載藥量為(2.96±0.07)%，膠束對藥物包裹率為(73.14±1.85)%。采用加壓超濾法所得膠束載藥量為(3.01±0.06)%，膠束對藥物包裹率為(74.49±1.62)%。兩種方法所得結果之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明離心超濾法中的離心過程對膠束包裹未產生顯著影響。

2.4膠束溶液的體外藥物釋放 EtoPM溶液和市售依托咪酯乳狀注射液在不同時間點的藥物累積釋放百分數(shù)見圖3。通過t檢驗分析兩組在第4小時時藥物釋放百分數(shù)之間的差異。結果表明，市售依托咪酯乳狀注射液藥物釋放較慢，其在4 h后平均累積釋放量僅約28%。而EtoPM膠束溶液對依托咪酯釋放速度較快，4 h后平均累積釋放量接近80%，顯著高于依托咪酯乳狀注射液累積釋放量(P<0.01)。因此，EtoPM溶液比市售依托咪酯乳狀注射液有顯著更快的釋藥速度。

2.5EtoPM溶液的體內藥效 EtoPM組(n=20)和依托咪酯乳狀注射液組(n=20)起效時間分別為(8.65±1.46)和(9.15±2.25) s。t檢驗分析顯示，兩組起效時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組大鼠單次尾靜脈注射后前爪翻正反射均迅速消失，表明EtoPM與依托咪酯乳狀注射液均能在體內快速起效。EtoPM組和依托咪酯乳狀注射液組麻醉后蘇醒所需時間分別為(514.7±77.9)和(587.3±57.4) s。通過t檢驗分析兩組麻醉后蘇醒所需時間差異，結果表明，與依托咪酯乳狀注射液比較，EtoPM溶液顯著縮短了大鼠麻醉后蘇醒所需平均時間(P<0.01)。此外，EtoPM組內雄性大鼠與雌性大鼠麻醉后蘇醒時間分別為(547.6±75.6)和(481.7±68.4) s，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。依托咪酯乳狀注射液組雄性大鼠與雌性大鼠麻醉后蘇醒時間分別為(611.6±58.6)和(563.0±47.1) s，差異無統(tǒng)計學意義。因此，本實驗條件下，大鼠性別對兩組藥物麻醉后蘇醒所需時間均無顯著影響。

①與市售依托咪酯乳狀注射液比較，t=13.22，P<0.01。

圖3 依托咪酯的體外釋放曲線(n=3)

①Compared with commercially available etomidate emulsion injection，t=13.22，P<0.01.

Fig.3 Invitrorelease profile of etomidate(n=3)

3 討論

依托咪酯是臨床應用最廣泛的靜脈麻醉藥物之一。依托咪酯水溶性較差，提高依托咪酯水溶性是增強其藥效的關鍵。膠束適用于疏水性藥物的增溶，且隨著膠束濃度的增加，藥物的表觀溶解度通常會相應增加。在20 ℃的PBS中，12 mg·mL-1普郎尼克F68即可以使依托咪酯表觀溶解度增加至1 mg·mL-1。為保證膠束溶液穩(wěn)定性，筆者在本研究采用較為過量的普郎尼克制備依托咪酯膠束溶液EtoPM。

同時，筆者對EtoPM溶液理化性質進行了研究。粒度儀測量結果顯示，EtoPM膠束平均粒徑約85 nm。電子顯微鏡下所觀察到的膠束粒徑(約25 nm)比粒度儀所測數(shù)據(jù)明顯更小，這主要是因為粒度儀利用動態(tài)光散射 (dynamic light scattering，DLS)原理測量在溶液狀態(tài)下的膠束粒徑，其值包含了顆粒表面附著的溶劑化層；而透射電子顯微鏡下觀察到的是干燥后的膠束顆粒，無溶劑化層，顆粒在干燥過程中可能發(fā)生一定程度的收縮，故而其數(shù)值比粒度儀所測值更小。此外，EtoPM膠束表面略帶負電，這主要是由普郎尼克分子兩端的羥基在水中發(fā)生部分解離產生的。

筆者在本研究考察普郎尼克膠束增溶后藥物的釋放行為。結果表明，與目前市售依托咪酯乳狀注射液相比，普郎尼克膠束溶液能更快地釋放藥物。乳狀注射液釋藥緩慢的主要原因可能與制含大豆油有關。大豆油不溶于水，在乳劑中作為油相，能較好地溶解依托咪酯，但其與藥物之間較強的疏水相互作用也會使得藥物難以離開油相而釋放到水相中。與大豆油相比，普郎尼克分子具有一定的親水性，與依托咪酯的疏水相互作用更小。此外，膠束增溶后的藥物分子狀態(tài)并不是靜止的，而是動態(tài)平衡的，即藥物分子仍可相對自由地從水相進入到膠束相以及從膠束相再逃逸到水相中[22]，因此普郎尼克膠束在有效增溶依托咪酯的同時能夠保證快速釋藥。與緩釋藥物制劑不同的是，盡管普郎尼克膠束對藥物的包裹率達到73%，但由于藥物在膠束相和水相中分布是動態(tài)平衡的，載藥膠束在漏槽條件下會迅速釋放藥物，因此將載藥膠束與未包裹的游離藥物完全分離開來較困難，而將EtoPM溶液整體作為一種注射液來研究則更合適。此外，由于普郎尼克投入量較大，盡管藥物包裹率較高，但載藥量還不理想。因此在今后的研究中，有必要對藥物/包裹材料投入比例進行優(yōu)化，以期在維持較高包裹率的同時獲得更高的膠束載藥量。

筆者在本實驗通過大鼠前爪翻正反射實驗考察了EtoPM溶液體內麻醉效果，同時與市售依托咪酯乳狀注射液進行比較。實驗結果顯示，兩組大鼠單次尾靜脈注射后前爪翻正反射均迅速消失，大鼠快速進入完全麻醉狀態(tài)并可順利置于仰臥位，表明EtoPM與依托咪酯乳狀注射液均能快速起效。值得注意的是，目前制備的EtoPM膠束溶液藥物濃度較低，可能使得給藥后腦內藥物不能較快達到有效濃度，因此導致EtoPM膠束溶液較市售脂肪乳注射液起效速度提升不明顯。由于普朗尼克膠束能夠較大程度地對依托咪酯進行增溶，因此筆者將對EtoPM膠束溶液的藥物濃度進行優(yōu)化提升，以期加快其起效速度，同時也使其滿足對全麻制劑快速起效的要求。另一方面，EtoPM溶液比乳狀注射液顯著縮短了大鼠麻醉后蘇醒的時間，這可能是由于普郎尼克膠束能夠促進藥物向腦內的轉運以及藥物的快速釋放，因為這兩種性質能有效減少依托咪酯在血液循環(huán)中的滯留，使藥物更快地進入腦內發(fā)揮作用以及被代謝。相比之下，乳狀注射液沒有腦靶向作用，且釋藥速度較緩慢，因而體內藥物會有更長作用時間，不僅造成麻醉后蘇醒時間的延長，同時也使藥物有更大的機會隨血液流動分布到體內其他部位，從而產生一定毒副作用。

綜上所述，普郎尼克膠束在有效增溶依托咪酯的同時能夠快速釋藥。EtoPM溶液在體內可以迅速起效。與市售依托咪酯乳液注射劑相比，EtoPM溶液麻醉后恢復蘇醒時間顯著更短，可能更滿足全麻藥物快速恢復蘇醒的要求，因此是一種很有潛力的依托咪酯注射液。此外，普郎尼克膠束有望促進依托咪酯向腦內的轉運，從而在一定程度上降低藥物對體內其他部位的毒副作用，但該功能還有待進一步體內外研究證實。