辛 懋, 龐富華, 黃 琳, 周小群, 王萌迪, 李金林, 李芳耀
(桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,廣西 桂林 541199)
Scheme 1
丹皮酚又稱芍藥醇、牡丹酚,化學(xué)名為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮,是一種從毛茛科植物牡丹的皮或蘿藦科植物徐長卿中提取的天然產(chǎn)物[1]。作為牡丹皮的主要活性成份,具有抗炎[2],抗腫瘤[3-7],抗動脈粥樣硬化[8],抗糖尿病[9],抗誘變[10]以及抗神經(jīng)炎癥[11]等活性。丹皮酚毒副作用小,簡單的結(jié)構(gòu)也使得結(jié)構(gòu)修飾過程便捷易行,是天然的活性先導(dǎo)化合物。
嘧啶是一類重要的含氮雜環(huán)化合物,是很多藥物中的活性結(jié)構(gòu)單元,嘧啶類化合物因其具有高效、低毒,藥理活性多樣及其環(huán)上取代基可以多方位變換等特點而備受藥物學(xué)家的關(guān)注。尤為重要的是眾多含嘧啶結(jié)構(gòu)的化合物具有良好的抗腫瘤活性,能抑制多種腫瘤細胞的形成、增殖,還可以誘導(dǎo)細胞凋亡[12-17]。代表性藥物氟尿嘧啶合成至今已有60余年歷史,抗腫瘤譜廣,目前仍是包括消化系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤的基礎(chǔ)性治療藥物。
雜合是獲得新型抗腫瘤藥物的有效的策略之一,雜合是利用拼合原理將兩個或多個活性物質(zhì)的藥效團嵌到一起形成一個全新的雜交分子,通過增加藥物的作用靶點,改變藥物對受體的作用方式以增強活性。有文獻[18-20]報道,四個碳原子的烷基鏈是良好的連接臂。
本文在前期研究基礎(chǔ)上[21-23],以丹皮酚(1)為先導(dǎo)化合物,利用拼合原理將丹皮酚與嘧啶兩種具有抗腫瘤活性的活性亞結(jié)構(gòu)進行拼合,合成一系列新型丹皮酚嘧啶類化合物(4a~4k, Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR、 IR和MS(ESI)表征。并采用MTT法測定化合物對HepG2(人肝癌細胞)、MCF-7(人乳腺癌細胞)、HCT-116(人結(jié)腸癌細胞)、A549(人肺癌細胞)和LO2(人正常肝細胞)等5種細胞的抑制活性。
WRX-4型熔點儀;Bruker AVANCE AV 600 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標);Simadzu Prestige-21 FT IR型紅外光譜儀(KBr壓片);Simadzu LCMS-8030型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;Infinite F500濾光片多功能酶標儀;OLYMPUS BX51型熒光倒置顯微鏡。
人肝癌細胞株HepG2、人乳腺癌細胞株MCF-7、人結(jié)腸癌細胞株HCT-116、人肺癌細胞株A549和人正常肝細胞LO2由桂林醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實驗室提供;其余所用試劑均為分析純。
(1) 2-(4-溴丁烷氧基)-4-甲氧基苯乙酮(2)的合成[24]
在250 mL的圓底燒瓶中加入12.50 g(15.0 mmol)與碳酸鉀2.10 g(15.0 mmol),用80 mL丙酮溶解;常溫攪拌下加入1, 4-二溴丁烷(2)5.50 mL(48.0 mmol),回流反應(yīng)6 h[TLC跟蹤,展開劑:V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1]。加入無水硫酸鎂,干燥過夜。過濾,濾液減壓蒸除溶劑,殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=10/1]純化得白色固體(2)2.60 g, Rf=0.28,收率58.0%, m.p.51.4~53.0 ℃; IRν: 2956(CH3), 1651(C=O), 1595, 1500, 1406, 1359, 1328, 1257, 1124, 1024, 837, 756, 646, 584, 522 cm-1。
(2) 6-取代苯基-5-氰基-2-硫代尿嘧啶(3a~3h)[25]
將氰乙酸乙酯1.13 g(0.01 mol), 0.76 g硫脲(0.01 mol),不同取代基的芳香醛(0.01 mol)和碳酸鉀1.38 g(0.01 mol)加入20 mL無水乙醇溶液中回流5~8 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)完成后產(chǎn)物以鉀鹽的形式析出,減壓抽濾,將沉淀溶解在溫水中后通過乙酸使其酸化而再次沉淀,減壓抽濾后干燥,經(jīng)乙酸重結(jié)晶,純化得6-取代苯基-5-氰基-2-硫代尿嘧啶(3a~3h)。
(3) 丹皮酚嘧啶類化合物(4a~4k)的合成
對于實時監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示,每次AJAX請求為盾構(gòu)機標識ID和當前時間戳TIMESTAMP,服務(wù)器端接收參數(shù)之后,從Redis數(shù)緩存中查詢出數(shù)據(jù),并以AJAX請求中常用的JSON數(shù)據(jù)傳輸格式返回數(shù)據(jù),對實時監(jiān)測頁面進行局部的數(shù)據(jù)更新,從而達到盾構(gòu)運行數(shù)據(jù)實時變化的目的。AJAX數(shù)據(jù)請求流程如圖7。
將新制備的2-(4-溴丁烷氧基)-4-甲氧基苯乙酮(2)0.30 g(1 mmol)溶解于裝有20 mL無水乙醇的圓底燒瓶中,加入不同的嘧啶類化合物(3a~3k, 1 mmol),以碳酸鉀為催化劑,水浴升溫至78 ℃,回流攪拌反應(yīng)約7~8 h,TLC跟蹤反應(yīng)進程(展開劑:V(氯仿)/V(甲醇)=2/1)待反應(yīng)結(jié)束后,加入無水硫酸鎂干燥過夜后過濾,濾液減壓蒸干后經(jīng)硅膠柱層析(展開劑:V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=1/1)純化得到目標化合物4a~4k。
6-(3-氟苯基)-5-氰基-4-羥基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4a): 白色固體,收率32.1%, m.p.81.7~83.6 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.82(dd,J=8.9 Hz,J=5.6 Hz, 2H), 7.65(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.27(t,J=8.9 Hz, 2H), 6.62(d,J=2.2 Hz, 1H), 6.58(dd,J=8.7 Hz,J=2.3 Hz, 1H), 4.14(t,J=6.1 Hz, 2H), 3.83(s, 3H), 3.07(t,J=6.8 Hz, 2H), 2.51(s, 3H), 1.88(dt,J=14.8 Hz,J=8.3 Hz, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.73, 172.45, 166.19, 164.73, 164.54, 162.09, 160.83, 134.68, 132.20, 130.90, 130.81, 120.74, 120.64, 115.58, 115.36, 106.47, 99.26, 88.99, 68.47, 56.05, 32.34, 29.75, 28.20, 26.65; IRν: 2 947(CH3), 2 214(CN), 1664(C=O), 1600, 1502, 1485, 1396, 1357, 1303, 1263, 1199, 1153, 1028, 999, 964, 796, 729, 646, 566, 507 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H22N3O4SF{[M+H]+}467.13, found 467.10。
6-苯基-5-氰基-4-羥基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4b): 淡黃色固體,收率78.0%, m.p.80.3~82.4 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.75(dd,J=7.0 Hz,J=2.7 Hz, 2H), 7.65(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.45(d,J=2.0 Hz, 2H), 7.44(d,J=1.7 Hz, 1H), 6.63(d,J=2.2 Hz, 1H), 6.58(dd,J=8.7 Hz,J=2.3 Hz, 1H), 4.14(t,J=6.1 Hz, 2H), 3.83(s, 3H), 3.07(t,J=6.8 Hz, 2H), 2.50(s, 3H), 1.92(dd,J=12.4 Hz,J=7.7 Hz, 2H), 1.84(dd,J=14.6 Hz,J=7.0 Hz, 2H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.74, 172.42, 170.88, 167.40, 164.74, 160.85, 138.30, 132.20, 130.07, 128.52, 120.78, 120.64, 106.51, 99.25, 89.16, 68.50, 56.06, 32.35, 29.77, 28.22, 26.66; IRν: 3086(CH3), 2229(CN), 1687(C=O), 1548, 1456, 1396, 1328, 1226, 1145, 1109, 1006, 856, 748, 698, 653, 547, 518 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H23N3O4S{[M-H]-}448.14, found 448.00。
6-(2-氟苯基)-5-氰基-4-羥基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4c): 棕黃色固體,收率10.7%, m.p.98.6~100.2 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.82(dd,J=8.7 Hz,J=6.0 Hz, 2H), 7.27(s, 1H), 6.55~6.45(m, 2H), 6.43(d,J=1.9 Hz, 2H), 4.05(d,J=6.2 Hz, 2H), 3.85(s, 3H), 2.79(d,J=7.9 Hz, 2H), 2.58(s, 3H), 2.03~1.90(m, 2H), 1.82(dt,J=14.6 Hz,J=7.2 Hz, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 197.69, 164.48, 164.46, 160.40, 160.11, 132.77, 132.71, 121.24, 121.21, 105.20, 105.08, 99.00, 98.91, 67.97, 67.73, 55.57, 55.55, 52.06, 32.11, 31.93, 31.78, 28.31, 26.26, 19.94; IRν: 2937(CH3), 1658(C=O), 1600, 1496, 1436, 1386, 1357, 1273, 1203, 1170, 1143, 1066, 1028, 966, 921, 827, 732, 642, 570, 524 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H22N3O4SF{[M+H]+}467.13, found 467.00。
6-(3-羥基苯基)-5-氰基-4-羥基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4d): 灰白色固體,收率47.1%, m.p.205.6~206.3 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.81(s, 1H), 7.64(d,J=8.5 Hz, 1H), 7.32(d,J=2.4 Hz, 3H), 6.95(d,J=7.8 Hz, 1H), 6.60(t,J=11.0 Hz, 2H), 4.13(s, 2H), 3.82(s, 3H), 3.29(s, 2H), 2.42(s, 3H), 1.91(s, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.60, 167.52, 164.70, 162.81, 160.69, 157.76, 155.70, 137.45, 132.22, 129.98, 122.95, 120.72, 119.68, 118.78, 115.72, 106.44, 99.35, 68.32, 62.82, 56.05, 32.21, 30.41, 28.09, 26.17; IRν: 3599, 3361, 3269, 2941(CH3), 2210(CN), 1664(C=O), 1573, 1469, 1301, 1269, 1205, 1174, 1141, 1020, 964, 812, 702, 636, 574, 470 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H23N3O5S{[M-H]-}464.14, found 464.00。
6-(4-甲基苯基)-5-氰基-4-羥基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4f): 白色固體,收率64.8%, m.p.102.4~104.0 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.86(d,J=8.2 Hz, 2H), 7.64(d,J=9.3 Hz, 1H), 7.32(d,J=8.1 Hz, 2H), 6.62~6.56(m, 2H), 4.12(s, 2H), 3.82(s, 3H), 3.34(s, 2H), 2.39(s, 3H), 2.37(s, 3H), 1.92(s, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.56, 167.49, 166.24, 164.68, 160.64, 142.58, 132.90, 132.24, 129.61, 129.10, 120.77, 116.51, 106.32, 99.44, 92.88, 68.21, 56.05, 32.15, 30.47, 28.08, 26.17, 21.53; IRν: 3344, 2937(CH3), 2204(CN), 1656(C=O), 1604, 1552, 1471, 1274, 1201, 1147, 1031, 1004, 829, 796, 725, 644, 570, 499 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C25H25N3O4S{[M-H]-}462.16, found 462.00。
6-(4-溴苯基)-5-氰基-4-羥基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4g): 白色固體,收率82.1%, m.p.224.4~226.1 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.87(d,J=8.6 Hz, 2H), 7.73(d,J=8.6 Hz, 2H), 7.64(d,J=9.3 Hz, 1H), 6.59(d,J=6.7 Hz, 2H), 4.12(s, 2H), 3.82(s, 3H), 3.34(s, 2H), 2.40(s, 3H), 1.91(s, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.55, 166.77, 166.58, 164.65, 161.33, 160.59, 134.87, 132.25, 131.03, 126.05, 120.76, 116.21, 106.29, 99.46, 93.64, 83.29, 68.19, 56.06, 32.15, 30.48, 28.04, 26.14; IRν: 3286, 2937(CH3), 2191(CN), 1653(C=O), 1600, 1539, 1465, 1259, 1195, 1099, 1068, 991, 827, 800, 725, 642, 613, 514 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C24H22N3O4SBr{[M-H]-}526.05, found 525.90。
6-(4-甲氧苯基)-5-氰基-4-羥基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4h): 黃色固體,收率67.2%, m.p. 223.1~224.6 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.83(d,J=8.9 Hz, 2H), 7.71(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.04(d,J=8.9 Hz, 2H), 6.69(d,J=2.3 Hz, 1H), 6.64(dd,J=8.7 Hz,J=2.3 Hz, 1H), 4.20(t,J=6.1 Hz, 2H), 3.88(s, 3H), 3.86(s, 3H), 3.12(t,J=6.9 Hz, 2H), 2.51(s, 3H), 1.97(dd,J=13.9 Hz,J=6.1 Hz, 2H), 1.90(dd,J=14.6 Hz,J=7.0 Hz, 2H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 196.70, 172.18, 171.12, 166.52, 164.71, 162.78, 160.88, 132.17, 130.56, 130.07, 121.14, 120.71, 113.83, 106.50, 99.30, 88.34, 68.52, 56.06, 55.70, 32.31, 29.76, 28.24, 26.72; IRν: 3207, 2950(CH3), 2364, 2204(CN), 1658(C=O), 1604, 1554, 1400, 1255, 1203, 1170, 1029, 1004, 972, 831, 802, 698, 648, 574, 513 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C25H25N3O5S{[M-H]-}478.15, found 478.00。
6-甲基-4-羥基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4i): 白色晶體,收率42.3%, m.p. 106.4~107.5 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.66(d,J=8.7 Hz, 1H), 6.71~6.53(m, 2H), 5.97(s, 1H), 4.14(t,J=5.7 Hz, 2H), 3.83(s, 3H), 3.20(t,J=6.6 Hz, 2H), 2.46(s, 3H), 2.15~2.05(m, 3H), 1.89(dtdd,J=14.5 Hz,J=11.1 Hz,J=5.5 Hz,J=2.3 Hz, 4H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ: 200.80, 170.14, 164.94, 164.73, 163.20, 160.50, 131.70, 121.23, 107.89, 102.67, 101.32, 69.40, 55.64, 31.98, 28.84, 28.20, 26.28, 24.74; IRν: 3574, 3126, 2949(CH3), 1653(C=O), 1593, 1452, 1402, 1251, 1205, 1026, 962, 908, 835, 565, 513, 530 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C18H22N2O4S{[M-H]-}361.13, found 361.00。
4-羥基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4j): 白色固體,收率28.6%, m.p. 75.5~77.9 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.83(d,J=8.7 Hz, 2H), 6.42(s, 2H), 6.37(d,J=5.7 Hz, 1H), 4.41(t,J=5.4 Hz, 2H), 3.84(s, 3H), 3.21(t,J=6.6 Hz, 2H), 2.58(s, 3H), 1.69(s, 2H), 1.26(s, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 197.68, 171.37, 168.59, 164.48, 160.42, 157.31, 132.74, 121.20, 105.09, 103.91, 98.93, 67.95, 55.54, 32.09, 30.44, 28.32, 25.93; IRν: 3292(NH), 2924(CH3), 1654, 1602, 1558, 1500, 1436, 1350, 1309, 1225, 1205, 1118, 1037, 987, 825, 640, 578, 514 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C17H20N2O4S{[M-H]-}348.11, found 348.80。
4, 6-二甲基-2-丹皮酚丁巰基嘧啶(4k): 淡黃色固體,收率61.2%, m.p. 75.5~77.9 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.83(d,J=8.7 Hz, 1H), 6.68(s, 1H), 6.51(dd,J=8.8 Hz,J=2.3 Hz, 1H), 6.43(d,J=2.3 Hz, 1H), 4.09(t,J=6.0 Hz, 2H), 3.84(s, 3H), 3.24(t,J=6.8 Hz, 2H), 2.55(s, 3H), 2.38(s, 6H), 2.07~2.00(m, 2H), 2.01~1.92(m, 2H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 197.72, 170.96, 166.99, 164.49, 160.52, 132.70, 121.14, 115.65, 105.05, 98.82, 68.02, 55.53, 32.15, 30.25, 28.24, 26.28, 23.88; IRν: 2945(CH3), 1656(C=O), 1598, 1533, 1436, 1396, 1359, 1263, 1195, 1134, 1029, 964, 831, 744, 555 cm-1; MS(ESI)m/z: calcd for C19H24N2O3S{[M-H]-}360.15, found 360.20。
將HepG2(人肝癌細胞)、MCF-7(人乳腺癌細胞)、HCT-116(人結(jié)腸癌細胞)、A549(人肺癌細胞)和LO2(人正常肝細胞)在DEME培養(yǎng)基:胎牛血清:雙抗(青鏈霉素)=100:10:1的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),以細胞每孔1×105的密度接種在96孔板中培養(yǎng),在96孔板的四周加入相同體積的PBS,輕輕拍打96孔板的周圍,使細胞分布均勻,分別按不同計量濃度加入順鉑、丹皮酚及合成的丹皮酚嘧啶類化合物并孵育44 h后每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)處理4 h,終止培養(yǎng)。離心,小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,最后每孔加入150 μL的DMSO,震蕩10 min’,使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀在490 nm的波長下測定每孔吸光度OD值,計算結(jié)果并按公式計算細胞生長抑制率:生長抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。所有實驗均重復(fù)3次后取平均值。IC50利用SPSS 23.0計算。
丹皮酚與1,4-二溴丁烷合成中間體2-(4-溴丁烷氧基)-4-甲氧基苯乙酮(2)的反應(yīng),采用丙酮為溶劑,碳酸鉀為縛酸劑,反應(yīng)溫度為60 ℃。由于丹皮酚的酚羥基與鄰位的羰基會生成分子內(nèi)氫鍵,形成穩(wěn)定的六元環(huán),因而酚羥基上的取代反應(yīng)變得較為困難,若溫度過低,反應(yīng)很慢。若反應(yīng)條件稍加劇烈(60~80 ℃),丹皮酚則易被氧化,且二溴丁烷上的兩個活潑溴原子會同時被丹皮酚的酚羥基取代,生成二醚副產(chǎn)物,導(dǎo)致目標產(chǎn)物的收率降低。為降低二醚副產(chǎn)物,實驗中加了過量的二溴丁烷。采用氫氧化鈉為催化劑時,易發(fā)生消除,產(chǎn)生烯烴副產(chǎn)物。
由4a~4k的IR譜圖可知,在2 960 cm-1左右范圍內(nèi)為甲基對稱和不對稱的伸縮振動峰,在1 620 cm-1左右有C=O的伸縮振動峰,在2 250 cm-1左右有CN的伸縮振動峰,在1 680~1 500 cm-1范圍為苯環(huán)的骨架伸縮振動峰,1 000~650 cm-1內(nèi)系苯環(huán)上氫的彎曲振動峰。
表 1 化合物的體外抗腫瘤活性
由1H NMR分析(圖略)可知,苯環(huán)和嘧啶環(huán)上的氫的特征峰位于δ6.20~8.00,甲氧基氫的特征峰位于δ3.84左右;苯乙酮上甲基氫的特征峰位于δ2.61附近;嘧啶環(huán)上甲基氫的特征峰位于δ2.32~2.36。
測定了丹皮酚嘧啶類化合物4a~4k對HepG2(人肝癌細胞)、MCF-7(人乳腺癌細胞)、HCT-116(人結(jié)腸癌細胞)、A549(人肺癌細胞)、LO2(人正常肝細胞)的體外抗腫瘤活性,陽性對照物為抗腫瘤藥物順鉑(Cisplatin),結(jié)果見表1。由表1可知,化合物4c和4i對HCT-116抑制活性較高,其IC50值分別為(9.22±1.80)μg/mL、(1.32±0.71)μg/mL,優(yōu)于陽性對照藥。且以上實驗,目標化合物對人正常肝細胞LO2的毒性皆小于順鉑。大部分化合物對腫瘤細胞的抑制作用均強于丹皮酚,因此在丹皮酚骨架中引入嘧啶部分,有利于丹皮酚抗腫瘤活性的提高。化合物4c及4i對人結(jié)腸癌細胞株HCT-116毒性優(yōu)于順鉑,值得進一步深入研究。
合成了11種新型的丹皮酚嘧啶類化合物,并對目標化合物進行了初步的抗腫瘤活性測試。結(jié)果表明,部分化合物對HepG2、MCF-7、HCT-116、A549腫瘤細胞顯示一定的抗腫瘤活性,化合物4i對HCT-116的IC50為(1.32±0.71)μg/mL,顯著優(yōu)于陽性對照藥順鉑,具有進一步研究的價值。