去泛素化酶3在子宮肌瘤中的表達(dá)及對子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響

高光玲 李楊 杜玲莉 李珍珠 蔣海霞

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)疾病中的常見腫瘤，是發(fā)生于子宮的良性腫瘤，通常以切除子宮作為治療手段[1]。缺失子宮不僅使患者喪失生育能力，而且有可能誘發(fā)盆底功能障礙性疾病，給患者生活造成嚴(yán)重影響。去泛素化酶3(ubiquitin-specific protease 3，USP3)屬于去泛素化酶家族成員，由520個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為59 kD，可斷裂脯氨酸殘基的連接[2]。USP3具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是泛素特異性蛋白酶活性區(qū)域，另一個(gè)為鋅指泛素連接結(jié)構(gòu)域，其在腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。有研究表明，USP3可通過與鼠雙微基因2(mouse double minute 2，MDm2)蛋白相互作用，從而促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖[4]。Nicassio等也證實(shí)，將人骨肉瘤U2OS細(xì)胞中USP3的表達(dá)敲低后，細(xì)胞增殖受到顯著抑制[5]。而USP3在子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著何種作用，目前鮮有報(bào)道。為探究USP3在子宮肌瘤中的表達(dá)水平及其對于子宮肌瘤細(xì)胞的增殖、凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)檢測了子宮肌瘤組織和細(xì)胞中USP3的表達(dá)量，然后通過RNA干擾技術(shù)[6]敲低USP3表達(dá)后觀察了細(xì)胞的增殖、凋亡情況，并檢測了p53和MDm2的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年4月至2018年7月于我院接受子宮肌瘤切除手術(shù)的56例患者為研究對象。年齡(30～62)歲，平均(46.39±1.81)歲；體重(40～61.5)kg，平均(55.75±4.69)kg；病程(3～18)個(gè)月，平均(11.1±4.4)個(gè)月；子宮肌瘤直徑(3～11)cm，平均(7.7±1.3)cm；手術(shù)時(shí)間(37.7±15.5)min?；颊呔鶡o其他嚴(yán)重并發(fā)癥。本研究已獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及其家屬知情并簽署同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[7]中子宮肌瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床表現(xiàn)為子宮出血、腹部包塊及壓迫癥狀、疼痛、不孕與流產(chǎn)及貧血等，借助超聲檢查并最終通過病理診斷進(jìn)行確診。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：生殖道發(fā)生急性感染患者；臨床資料不完整或丟失的患者；伴有嚴(yán)重原發(fā)性疾病患者；伴有其他婦科疾病引起子宮炎癥患者。

1.3 RT-PCR檢測 所有患者術(shù)后從子宮肌瘤瘤體取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織1塊，作為觀察組樣本；從瘤體旁正常平滑肌組織中取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織1塊，作為對照組樣本。提取所有樣本RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix(AT401-01)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。根據(jù)GeneBank中USP3的序列(NR_046342.1)并借助primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(F：5’-TGAATGCCATCCTTCAGTCA-3’；R：5’-CTTGGCTCCTGGTGTGGTAT-3’)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。將上述cDNA作為模板，按照PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃，5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳后置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(SYSTEM GelDoc XR+,1708195)中成像。使用Image J分析軟件進(jìn)行灰度值分析，檢測USP3的轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 Western blot檢測 將從武漢博士德公司購買的子宮肌瘤細(xì)胞和購自北納生物的子宮平滑肌細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以3.0×105個(gè)/孔的密度接種12孔板，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V,20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印槽(Trans-Blot SD,170-3940)在恒壓15 V，30 min條件下轉(zhuǎn)印至PVDV膜(生工，F(xiàn)019532-0010)。取下PVDF膜放入封閉液(TBST，5%脫脂奶粉，pH值7.4)中室溫孵育2 h；使用sigma公司生產(chǎn)的USP3一抗稀釋液(SAB1410046，1∶5 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生產(chǎn)的HRP標(biāo)記的二抗羊抗鼠IgG 稀釋液(HS201-01,1∶10 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光液(上海天能)使用說明，將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 免疫組化法檢測 將子宮肌瘤組織及瘤體旁正常平滑肌組織分別置于4%多聚甲醛中過夜固定，石蠟包埋處理后，將標(biāo)本進(jìn)行4 μm厚度切片。將切片放置于多聚賴氨酸處理的蓋玻片上，經(jīng)脫蠟、水化及熱抗原修復(fù)后，按照免疫組化SP試劑盒(福州市邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，KIT-9710)的說明書進(jìn)行操作。USP3一抗稀釋濃度為1∶1 000。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。在400倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，以公式：陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)，求出陽性細(xì)胞率。

1.6 RNA干擾 針對USP3的序列(613-635，AGCTACAGTACATACTGTTATCG)，利用在線工具siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)設(shè)計(jì)并合成小干擾RNA(Small interfering RNA；siRNA):5’-AUAACAGUAUGUACUGUAGCU-3’及5’-CUACAGUACAUACUGUUAUCG-3’。同時(shí)合成陰性對照siRNA：5’-UACUUAUAACGUAGCAGUAUG-3’及5’-AUGAAUAUUGCAUCGUCAUAC-3’。將子宮肌瘤細(xì)胞分為3組，其中轉(zhuǎn)染陽性siRNA的為siRNA-USP3組；轉(zhuǎn)染陰性siRNA的為siRNA-control組；轉(zhuǎn)染同體積PBS的為對照組。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，利用Western blot方法檢測3組細(xì)胞中的USP3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞增殖及凋亡檢測 按上述RNA干擾方法獲得的3組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(GLPBOI，GK10001)檢測各組細(xì)胞的增殖情況。同時(shí)利用Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Sigma，APOAF-20TST)檢測各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后0 h,12 h,24 h,36 h和48 h的凋亡情況。

1.8 p53和MDm2表達(dá)水平檢測 收集上述3組細(xì)胞，利用Western blot方法檢測3組細(xì)胞中的USP3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 USP3在子宮肌瘤組織和正常子宮肌層組織中的表達(dá)水平比較 USP3在觀察組中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對照組(P<0.05)；Western blot檢測的USP3在觀察組中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)；免疫組化結(jié)果顯示，與對照組比較，觀察組中含有棕黃色染色顆粒的細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 USP3在子宮肌瘤組織(觀察組)和正常子宮肌層組織(對照組)中的轉(zhuǎn)錄(A)及表達(dá)(B、C)水平

組別USP3USP3陽性細(xì)胞率(%)對照組0.22±0.041.30±0.2618.29觀察組0.78±0.16?2.79±0.56?88.98t值25.41018.06078.080P值<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 USP3在子宮肌瘤細(xì)胞和子宮平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平比較 USP3在子宮肌瘤細(xì)胞中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于子宮平滑肌細(xì)胞(P<0.05)；USP3在子宮肌瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著高于子宮平滑肌細(xì)胞(P<0.05)。見圖2，表2。

2.3 RNA干擾效果檢測 3組細(xì)胞間的USP3蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組細(xì)胞和siRNA-control組細(xì)胞間的中USP3蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)；與對照組細(xì)胞和siRNA-control組細(xì)胞相比，siRNA-USP3組細(xì)胞中內(nèi)的USP3蛋白的表達(dá)受到顯著抑制(P<0.05)。見圖3，表3。

圖2 USP3在子宮肌瘤細(xì)胞和子宮平滑肌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄(A)和表達(dá)(B)水平

組別USP3(轉(zhuǎn)錄)USP3(表達(dá))子宮平滑肌細(xì)胞0.29±0.080.35±0.07子宮肌瘤細(xì)胞 1.02±0.20?1.05±0.21?t值7.5787.071P值<0.001<0.001

注：與子宮平滑肌細(xì)胞比較，*P<0.05

圖3 RNA干擾效果

表3 RNA干擾效果

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

2.4 USP3敲低對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響 對照組和siRNA-control組細(xì)胞數(shù)均隨時(shí)間而增多；而siRNA-USP3組細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)12 h之后隨時(shí)間呈下降趨勢。對照組和siRNA-control組細(xì)胞數(shù)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P>0.05)；與對照組和siRNA-control組相比，siRNA-USP3組細(xì)胞數(shù)在24 h，36 h和48 h時(shí)顯著降低(P<0.05)。見表4，圖4。

2.5 USP3敲低對子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響 3組細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間增加，凋亡細(xì)胞均呈增長趨勢。3組細(xì)胞凋亡率在12 h之前無顯著差異(P>0.05)；在12 h之后各時(shí)間點(diǎn)的凋亡率差異顯著(P<0.05)；對照組細(xì)胞和siRNA-control組細(xì)胞數(shù)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P>0.05)；與對照組和siRNA-control組相比，siRNA-USP3組的細(xì)胞凋亡比例在24 h、36 h和48 h時(shí)顯著增加(P<0.05)。見圖5,表5。

組別0h12h24h36h48h對照組 1.00±0.181.82±0.352.66±0.534.01±0.805.33±1.07siRNA-Control組1.00±0.141.74±0.332.71±0.544.27±0.855.28±1.06siRNA-USP3組 1.00±0.161.58±0.321.61±0.32?#1.55±0.31?#1.49±0.30?#F值0.0000.6718.57523.17030.860P值1.0000.5290.005<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

圖4 USP3敲低對子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響

2.6 USP3敲低對子宮肌瘤細(xì)胞中p53和MDm2表達(dá)的影響 3組細(xì)胞間p53和MDm2的表達(dá)均存在顯著差異(P<0.05)；兩種蛋白在對照組和siRNA-control組中的表達(dá)無差異(P>0.05)；p53在siRNA-USP3組細(xì)胞中表達(dá)顯著高于對照組和siRNA-control組(P<0.05)；MDm2在siRNA-USP3組細(xì)胞中表達(dá)顯著低于對照組和siRNA-control組(P<0.05)。見圖6，表6。

圖5 USP3敲低對子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響

表5 USP3敲低對子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

圖6 USP3敲低對子宮肌瘤細(xì)胞中p53(A)和MDm2(B)表達(dá)的影響

表6 USP3敲低對子宮肌瘤細(xì)胞中p53及MDm2表達(dá)的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

3 討論

李根[4]在研究USP3對肝癌細(xì)胞增殖時(shí)發(fā)現(xiàn)，USP3在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，且USP3可與MDm2相互作用。此外，F(xiàn)ang等[8]的研究證實(shí)，USP3過表達(dá)，可誘發(fā)胃部癌變，可作為胃癌患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)USP3在子宮肌瘤組織中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常平滑肌組織。而且，在子宮肌瘤細(xì)胞中同樣檢測到了較高水平的USP3蛋白的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)與上述研究較為一致，表明USP3確實(shí)在子宮肌瘤組織和細(xì)胞中存在異常表達(dá)。

為保證正常的細(xì)胞周期，細(xì)胞可利用泛素-蛋白酶體途徑降解多余的蛋白。去泛素化酶可以水解靶蛋白上的泛素分子，阻止靶蛋白被降解，通過此途徑調(diào)控蛋白質(zhì)水平，從而調(diào)控大部分生命過程[9]。然而正常細(xì)胞不受控制而異常增殖可誘發(fā)癌癥[10]。為確認(rèn)USP3是否能夠影響子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡。利用RNA干擾技術(shù)將子宮肌瘤細(xì)胞中USP3敲低，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡開始增加。這些都表明，USP3在子宮肌瘤細(xì)胞的增殖方面起著重要作用。

為進(jìn)一步確認(rèn)USP3促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞增殖機(jī)制，我們檢測了腫瘤抑制基因p53的表達(dá)情況。P53在抑制腫瘤增殖、保持基因組完整性方面起著重要作用。在靜息狀態(tài)下，p53在細(xì)胞中保持較低水平。遇到致癌應(yīng)激、DNA損傷等各種應(yīng)激時(shí)，p53迅速做出應(yīng)答[11]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，敲低USP3后，子宮肌瘤細(xì)胞中p53的表達(dá)顯著升高。可能由于USP3的高表達(dá)抑制了p53的表達(dá)并阻止其發(fā)揮功能。

此外，我們也檢測到USP3敲低的細(xì)胞中MDm2蛋白表達(dá)降低。這可能與p53的表達(dá)變化有關(guān)：由mdm2基因編碼產(chǎn)生的E3泛素連接酶MDm2蛋白可調(diào)控p53蛋白的降解[12,13]。MDm2與p53結(jié)合后，促進(jìn)泛素分子標(biāo)記p53，從而使其降解，從而誘導(dǎo)細(xì)胞異常增殖、癌變[14]。根據(jù)前文提到的研究推測，USP3可能通過穩(wěn)定MDm2蛋白水平從而間接促進(jìn)p53蛋白降解，達(dá)到促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞增殖的效果。

本文尚有不足之處：選取的樣本量較少，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可能難以代表整體情況；檢測的指標(biāo)數(shù)量少，以后研究中還要選取多種調(diào)節(jié)因子，多方面闡述機(jī)制；如有條件，也可以構(gòu)建子宮肌瘤動(dòng)物模型，便于進(jìn)一步認(rèn)識子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制。

綜上所述，USP3在子宮肌瘤中呈高表達(dá)，RNA干擾技術(shù)沉默USP3可以抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與抑制MDm2活性從而促進(jìn)p53表達(dá)有關(guān)。