Bmi-1及E-鈣黏蛋白在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

趙莉莉，楊筱青

鄭州市婦幼保健院婦產(chǎn)科，鄭州 450012

宮頸鱗狀細(xì)胞癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致其術(shù)后死亡的主要原因。最近，越來越多的證據(jù)表明，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是一種對(duì)細(xì)胞連接非常重要的跨膜蛋白，可抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，其下調(diào)或丟失被認(rèn)為是EMT的標(biāo)志。上皮細(xì)胞中E-cadherin的減少或喪失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從腫塊中脫落，這是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的先決條件[1-2]。文獻(xiàn)報(bào)道，Bmi-1基因在人類腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的致癌作用[3]。Bmi-1可通過調(diào)控EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[4]。但目前Bmi-1和E-cadherin在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及關(guān)系國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未報(bào)道，故本研究檢測宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1、E-cadherin的表達(dá)，并探討其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年9月至2012年11月鄭州市婦幼保健院收治的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的病歷資料，所有患者術(shù)前均未行放化療、生物治療，均經(jīng)病理檢查確診。共收集宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者138例，年齡28～69歲，中位年齡48歲，≥48歲71例，＜48歲67例；高中分化60例，低分化78例；浸潤深度：≤1/2 68例，＞1/2 70例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移81例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例；臨床分期：Ⅰ期72例，Ⅱ期66例。取138例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織，另外取60例因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)患者的正常宮頸組織。

1.2 檢測方法

兔抗人Bmi-1多克隆抗體、鼠抗人E-cadherin多克隆抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology Inc公司，SP試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。將組織石蠟塊制成4 μm厚切片，采用免疫組織化學(xué)SP法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作；一抗均按1∶100稀釋。用已知陽性片作為對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

采用雙盲法，由兩位資深病理科醫(yī)師同時(shí)獨(dú)立觀察每張切片后判定Bmi-1、E-cadherin的表達(dá)情況。Bmi-1主要表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒樣染色；E-cadherin主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色顆粒樣染色。判定標(biāo)準(zhǔn)采用半定量評(píng)分法，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比（%）和染色強(qiáng)度進(jìn)行判定。陽性細(xì)胞所占百分比：無陽性細(xì)胞為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積，總分≥4分為陽性。

1.4 隨訪

隨訪截止日期為2017年11月，生存時(shí)間為手術(shù)日期至隨訪截止日期，或手術(shù)日期至因復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期，截尾值指定為0。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；兩變量之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，Log-rank法比較生存曲線；多因素分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常宮頸組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1、E-cadherin 表達(dá)的比較

宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織，E-cadherin陽性表達(dá)率明顯低于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖1、表1）

圖1 正常宮頸組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1、E-cadherin的表達(dá)（SP，×400）

表1 正常宮頸組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1、E-cadherin陽性表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1、E-cadherin 陽性表達(dá)情況的比較

低分化、臨床分期為Ⅱ期、浸潤深度＞1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1陽性表達(dá)率均高于高中分化、臨床分期為Ⅰ期、浸潤深度≤1/2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.490、5.337、7.237、18.564，P＜0.05）；低分化、臨床分期為Ⅱ期、浸潤深度＞1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中E-cadherin陽性表達(dá)率均低于高中分化、臨床分期為Ⅰ期、浸潤深度≤1/2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.637、8.970、17.498、18.180，P＜0.05）；不同年齡的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1、E-cadherin陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1、E-cadherin陽性表達(dá)情況（n=138）

2.3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.626，P＜0.01）。

2.4 Bmi-1、E-cadherin 陽性表達(dá)情況與宮頸鱗狀細(xì)胞癌生存的關(guān)系

對(duì)138例患者進(jìn)行隨訪，失訪率為6.5%。Bmi-1陽性表達(dá)患者生存時(shí)間明顯短于陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.864，P＜0.01）（圖 2）；E-cadherin陽性表達(dá)患者生存時(shí)間明顯長于陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.411，P＜0.01）（圖3）。

圖2 Bmi-1陽性表達(dá)（n=105）與陰性表達(dá)（n=33）宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的生存曲線

圖3 E-cadherin陽性表達(dá)（n=42）與陰性表達(dá)（n=96）宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的生存曲線

2.5 宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的多因素分析

將年齡、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Bmi-1表達(dá)及E-cadherin表達(dá)分別進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，低分化、臨床分期為Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Bmi-1陽性表達(dá)和E-cadherin陰性表達(dá)均為宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表3）

表3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析（n=138）

3 討論

人Bmi-l基因位于染色體10p13位點(diǎn)上，DNA 4.9 kb，mRNA 3199 bp，編碼蛋白質(zhì)含有326個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為36.9 kD[5]；作為polycomb基因家族成員，Bmi-l在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞發(fā)生和細(xì)胞衰老中起關(guān)鍵作用，參與癌癥的發(fā)生；參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。Allegra等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1在喉鱗狀細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率為84.4%，呈高表達(dá)。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤的臨床分期、浸潤深度和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bmi-l在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織，提示Bmi-1的高表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1蛋白陽性表達(dá)與年齡無關(guān)；而低分化、臨床分期為Ⅱ期、浸潤深度＞1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Bmi-1陽性表達(dá)率均高于高中分化、臨床分期為Ⅰ期、浸潤深度≤1/2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明Bmi-l的高表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；分析其原因可能Bmi-1通過調(diào)控EMT，可促進(jìn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[4]。Jiang等[9]研究了在人宮頸癌細(xì)胞系HeLa中抑制Bmi-1表達(dá)的小干擾RNA（siRNA）的生物學(xué)效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bmi-1siRNA可抑制HeLa細(xì)胞中Bmi-1RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，顯著影響體外和體內(nèi)HeLa細(xì)胞的增殖、集落形成和遷移。因此，沉默Bmi-1可以抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，Bmi-1可El-Hadaad能是治療宮頸癌的新型治療靶點(diǎn)。Abd El hafez和El-Hadaad[10]研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞中Bmi-1的表達(dá)與患者的平均生存率存在顯著負(fù)相關(guān)，Bmi-1高表達(dá)的患者生存時(shí)間較短，預(yù)后差。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bmi-1陽性表達(dá)患者預(yù)后明顯差于陰性表達(dá)患者，宮頸癌組織中Bmi-1高表達(dá)的患者生存率顯著下降，提示Bmi-1的高表達(dá)與宮頸癌的預(yù)后密切相關(guān)。多因素Cox分析結(jié)果顯示，Bmi-1陽性可作為宮頸鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此Bmi-1可能成為預(yù)測宮頸鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，為宮頸癌的早期診斷、治療和預(yù)后提供依據(jù)。

EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。E-cadherin是鈣黏蛋白家族的成員之一，是一種對(duì)細(xì)胞連接非常重要的跨膜蛋白，它抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，其下調(diào)或丟失被認(rèn)為是EMT的標(biāo)志。上皮細(xì)胞中E-cadherin的下調(diào)或喪失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從腫塊中脫落，這是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的先決條件[1-2]。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織的分化程度、臨床分期、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即隨著惡性腫瘤的分化程度越差、浸潤深度越深、臨床分期越晚和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，E-cadherin陽性表達(dá)率降低或缺失，因此，E-cadherin的表達(dá)降低或缺失，是宮頸鱗狀細(xì)胞癌浸潤、轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素。多因素Cox分析結(jié)果顯示，E-cadherin可作為宮頸鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

Zhang等[11]研究結(jié)果表明Bmi-1通過下調(diào)E-cadherin誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究結(jié)果提示宮頸癌細(xì)胞中Bmi-1高表達(dá)，E-cadherin低表達(dá)，且二者呈負(fù)相關(guān)，因此，可以推測Bmi-1可能通過抑制E-cadherin的表達(dá)誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Bmi-1、E-cadherin可能成為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的新型治療靶點(diǎn)和預(yù)測宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的新指標(biāo)。