適用于醬油釀造乳酸菌的篩選及應用

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摘 要：從低生物胺醬醪中篩選出1株嗜鹽四聯球菌，經2號濾紙過濾及鏡檢證實，該菌株是以幾個細胞連接的狀態(tài)進行生長繁殖，在整個生長過程中不產生生物胺，用于醬油釀造中可大大減少醬油二次沉淀的生成量，亦可提高醬油生物安全性。因此，在醬醪發(fā)酵階段添加嗜鹽四聯球菌，是解決國產醬油二次沉淀和生物胺問題的有效手段。

關鍵詞：醬油;乳酸菌;沉淀;生物胺

中圖分類號 TS264.21文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）12-0101-04

Abstract： In this study， a strain of T. halophilus was screened from the low-biological amine sauce mash. Filtering and microscopic examination of No. 2 filter paper confirmed that the strain was growing and multiplying with several cells connected; the strain did not Bio-amines are produced and used in soy sauce brewing， which can greatly reduce the amount of secondary precipitation of soy sauce， and can also improve the safety of bio-amines in soy sauce.

Key words：Soy sauce; Lactic acid bacteria; Sediment; Biogenic amine

醬油在調味品行業(yè)中占有重要地位，在呈香、味、色方面已具有其他調味品不可替代的功能。醬油釀造是以源自大豆和小麥的植物蛋白質及碳水化合物為主要原料，生產涉及到多種有益微生物的聯合協同作用。其中最重要的是乳酸菌和酵母菌，它們主要作用是發(fā)酵糖類產生醇、醛、酸、酯、酚類等風味物質。其中乳酸菌是醬油發(fā)酵醪中主要的微生物，在發(fā)酵過程中，耐鹽性乳酸菌產生乳酸、乙酸等種類豐富的有機酸，從而使整個發(fā)酵體系的pH值開始下降，當發(fā)酵體系的pH值下降至適宜酵母菌生長繁殖的時候，耐鹽酵母菌便開始大量生長繁殖，生產以醇類為主的各種小分子物質，賦予醬油特有的醇味，同時大量的醇類物質與有機酸發(fā)生酯化反應產生酯類等風味物質，賦予醬油特有的風味。

乳酸菌（Lactic acid bacteria， LAB）是一類能利用可發(fā)酵糖類產生大量乳酸的細菌統稱，有球菌、桿菌之分。發(fā)酵醬油中添加乳酸菌，不僅能提高醬油的營養(yǎng)價值，還可改善醬油的風味。目前，國內外對乳酸菌用于醬油后發(fā)酵以促進醬油香氣和風味形成的研究很多，崔瑞迎等將耐鹽乳酸菌用于高鹽稀態(tài)發(fā)酵，發(fā)現醬醪中2-甲基丁酸、2-甲基丁醇、乙酸異戊酯質量分數分別較對照組高53.4%、337.3%、388.2%。嚴留俊對乳酸菌增加醬油風味進行了探討性研究，確定了多菌種混合順序變溫發(fā)酵法進行醬油發(fā)酵的可行性。劉卓研究了添加耐鹽乳酸菌與醬醪中的酵母的協同作用，以及耐鹽乳酸菌對發(fā)酵工藝的控制和對醬油主要風味的影響。結果表明，在醬醪發(fā)酵過程中，添加耐鹽乳酸菌明顯促進T酵母的生長，而與S酵母存在著相互促進的關系。結合廣式高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的工藝特點與乳酸菌的形態(tài)結構及乳酸菌的代謝產物對乳酸菌進行更深層次的研究發(fā)現，乳酸菌種類中的嗜鹽片球菌在醬醪中是以多個細胞集聚存在的，半成品原油過濾后（燭式過濾器），可去除大部分乳酸菌菌體，從而減少貨架期醬油的二次沉淀。經研究表明，一些乳酸菌可進一步分解醬醪中的酪氨酸、組氨酸等氨基酸態(tài)氮生成生物胺等有害物質，影響醬油口感，危害人體健康。

筆者選取低生物胺醬醪進行耐鹽乳酸菌的分離，并根據其細胞形態(tài)、代謝產物等篩選出適用于醬油釀造的乳酸菌菌株，以解決醬油行業(yè)普通存在的二次沉淀難題，降低醬油中有毒有害物質含量，提高醬油品質及風味。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 釀造醬油生產原料：黃豆、面粉、麩皮，從市場采購。曲霉：廣東美味鮮調味食品有限公司菌種庫提供。醬醪：廣東美味鮮調味食品有限公司中山廠區(qū)所得，生物胺含量≤ 200mg/mL的發(fā)酵45d左右的醬醪;生物胺標準品（腐胺、尸胺、組胺、酪胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺）、乙酸鈉、乙氰、三乙胺、CuSO4、亞甲基藍、酒石酸鉀、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、AgNO3、NaOH、四硼酸鈉、Na2HPO4等均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司;L-組氨酸鹽酸鹽、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸鹽酸鹽、溴甲酚紫、磷酸吡哆醛，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器和設備 高效液相色譜儀：美國Waters分析儀器有限公司;Kjeitec2300凱氏定氮儀：瑞典FOSS分析儀器有限公司;WFZ UV-2100紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司;5415D高速離心機：德國艾本德股份公司;FE20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配方 MRS培養(yǎng)基（g/L）：酪蛋白胨10、牛肉浸取物10、酵母提取物5、葡萄糖20、乙酸鈉5、檸檬酸二胺2、吐溫80 1、磷酸氫二鉀2、七水硫酸鎂0.2、七水硫酸錳0.05、氯化鈉100，pH6.8，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

液體脫羧酶固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨酵母抽提物5.0、酵母粉5.0、牛肉膏5.0、葡萄糖0.5、氯化鈉100、檸檬酸銨2.0、磷酸氫二鉀2.0、MnSO4 0.2、FeSO4 0.04、碳酸鈣0.3、磷酸吡哆醛1.0、溴甲酚紫0.06、賴氨酸5.0、鳥氨酸鹽酸鹽5.0、L-組氨酸鹽酸鹽2.0、色氨酸2.0、酪氨酸1.0、pH5.3，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

固體脫羧酶培養(yǎng)基（g/L）：瓊脂粉20，其他成分同液體脫羧酶培養(yǎng)基，pH5.3，121℃高壓蒸汽滅菌10min。

1.3 乳酸菌分離純化

1.3.1 乳酸菌富集培養(yǎng) 取低生物胺醬醪10g，接種于100mL高鹽MRS液體培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)5d。

1.3.2 不產生物胺乳酸菌初篩 將富集培養(yǎng)后的菌液用無菌生理鹽水進行稀釋，取不同梯度的稀釋液100μL于固體脫羧酶培養(yǎng)基上進行涂布，于32.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，挑取黃色或白色陰性菌落并編號，多次劃線純化后接種于液體MRS培養(yǎng)基，于32.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后置于4℃冰箱保存。

1.3.3 高效液相色譜復篩 將初篩菌株接種于液體脫羧酶培養(yǎng)基中，32.5℃培養(yǎng)5d，對其發(fā)酵液進行HPLC檢測。

（1）標準溶液的制備。準確稱取生物胺各50mg，用丙酮配制成1mg/mL的儲備液備用。分別取以上標準品儲備液1mL，用丙酮配制成最終濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、15、25、50mg/L的混合標準溶液，鋁箔包住，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）標準溶液的前處理。取1mL各梯度的標準溶液于10mL離心管中，加入1mL丹黃酰氯溶液、1mL飽和NaHCO3溶液，渦旋混勻，60℃水浴30min，每隔10min開蓋放氣搖勻。待溶液溫度降至室溫后，加入100μL氨水，混勻，60℃水浴15min，取出冷卻至室溫。向其中加入3mL乙醚進行萃取，待渦旋混勻后靜置1h，吸取上層有機層于新的離心管中，向下層溶液中重新加入3mL乙醚，重新萃取2次。對所收集的上層液進行60℃吹氮，待吹干后，向離心管中加入1mL乙腈，晃動使乙腈充分接觸離心管壁，用0.22μL的有機膜過濾[10]。

（3）樣品的前處理。把培養(yǎng)5d的液體脫羧酶培養(yǎng)液進行12000r/min離心10min，取1mL上清液加入10mL離心管中，再加入1mL丹黃酰氯溶液、1mL飽和NaHCO3溶液，進行衍生。衍生、萃取步驟同標準溶液。

（4）色譜分析。色譜條件：GEMINI C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，美國phenomenex公司），檢測波長254nm，進樣量20μL，柱溫30℃，流速1mL/min。流動相A為超純水，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序為：0～1min，B=65%（體積分數）;1～10min，B=80%（體積分數）;10～15min，B=90%（體積分數）;15～25min，B=90%（體積分數）;25～30min，B=65%（體積分數），外標法定量。

1.3.4 依據菌體形態(tài)進行復篩 高鹽MRS培養(yǎng)液，通過顯微鏡觀察菌落形態(tài)，并通過2號濾紙過濾，對比過濾前后菌液的澄清度。

1.3.5 適于醬油釀造的菌株16S rDNA鑒定篩選 該步驟由廣東省微生物研究中心完成，并給出檢測報告，確定該菌株的種屬。

1.3.6 乳酸菌的應用 將不產生物胺且通過2號濾紙過濾澄清的菌株應用于醬油釀造中，跟進發(fā)酵結束后醬油的生物胺含量及二次沉淀的含量。具體步驟為：（1）實驗室規(guī)模制作大曲：蒸熟的黃豆與面粉按照1∶0.4比例混合，接種米曲霉3.042，裝入鋁飯盒中于30℃恒溫培養(yǎng)44h，制得成熟的大曲。（2）實驗室規(guī)模制醪：150g大曲與450g濃度為25%的鹽水混合制成醬醪，裝于1L三角瓶中。（3）將擴大培養(yǎng)好的菌株擴培液分別添加至醬醪中，使得每瓶醬醪中的細胞數達到106 CFU/mL，以不添加菌株的醬醪為對照樣。（4）將混有菌株的醬醪放置在30℃培養(yǎng)箱，恒溫發(fā)酵30d，每10d檢測上清液的pH。發(fā)酵完成后，送檢水黃中組胺和酪胺的含量，進而判斷菌株產生物胺的能力，同時留樣觀察減少二次沉淀的效果。

2 結果與分析

2.1 固體脫羧酶培養(yǎng)基初篩 通過脫羧酶固體培養(yǎng)基平板顯色試驗進行不產生物胺乳酸菌的初步篩選，如圖1所示，顯色培養(yǎng)基上的菌落顏色有紫色、白色和黃色。根據平板顯色原理，由于生物胺為堿性物質，因此產生物胺菌的菌落會使指示劑變?yōu)樽仙?，不產生物胺菌的菌落為黃色，通過平板初次篩選得到26株疑似不產生物胺的乳酸菌，編號分別為M1～M26。

2.2 HPLC檢測復篩 為了確認初步篩選到的26個陰性菌株是否為不產生物胺的菌株，采用HPLC法檢測26個菌株發(fā)酵液中的生物胺含量，結果如表1所示。

由表1可知，通過HPLC法檢測，有3株菌（編號為M3、M6、M26）均不產生生物胺，有15株只產生組胺，有8株產生組胺和酪胺2種生物胺。

2.3 細胞形態(tài)復篩 分析醬油二次沉淀形成的主要原因為微生物菌體，結合醬油生產工藝可以得出，菌體細胞抱團生長（4個或者8個細胞連接在一起）的菌株在二次沉淀方面有一定的作用，因此采用2號濾紙過濾菌液，過濾后澄清的菌株適用于醬油釀造。編號為M3、M6、M26的菌株顯微鏡細胞形態(tài)及過濾前后的結果如圖2所示。

如圖2所示，菌株M6細胞是不集聚生長，濾液經過過濾后仍然渾濁;菌株M3細胞是不集聚生長，過濾后的濾液雖然較未過濾前澄清，但仍有少量渾濁不透明，M26菌株細胞是集聚生產，菌液經過過濾后，濾液澄清透明。通過上述2次篩選后，M26菌株不產生物胺且2號濾紙過濾后澄清透明，該菌株可以用于醬油釀造，因此將該菌株進行分子鑒定，確定其種屬。

2.4 16S rDNA鑒定結果 經16S rDNA鑒定，菌株M26為嗜鹽四聯球菌。該菌株分解糖類物質，產生有機酸，提高醬油風味，且細胞形態(tài)為集聚生長，可大大減少醬油二次沉淀的生成量。

2.5 乳酸菌應用效果 由表2、3可知，在醬油發(fā)酵期間添加嗜鹽四聯球菌M26，發(fā)酵結束后添加M26菌種的醬油生物胺較未添加的減少80.3%，添加M26后醬油二次沉淀析出時間校未添加的晚15d，且放置60d時試驗樣醬油二次沉淀減少89.56%。說明在醬油發(fā)酵期間添加M26菌種，可以減少醬油中的二次沉淀，同時降低天然油中生物胺含量。

3 結論與討論

試驗結果表明，從低生物胺醬醪中分離得到1株嗜鹽四聯球菌M26，其細胞形態(tài)為集聚生長，可大大減少醬油二次沉淀的生成量，改善了醬油外觀品質;該菌株不產生生物胺，將其添加到醬油發(fā)酵醬醪中可降低醬油生物胺的含量，提高了醬油生物安全性;該菌株分解糖類物質，產生有機酸，在一定程度上能改善醬油風味。下一步將對該嗜鹽四聯球菌改善醬油二次沉淀的機理及其在醬油大規(guī)模生產中的應用進行深入研究。

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（責編：徐世紅）