紫花苜蓿（Medicago sativa）高效根瘤菌菌劑研究

楊瑾瑾 王宏偉 劉朋飛

摘要 基于已獲得高效紫花苜蓿根瘤菌菌株的基礎(chǔ)上，以生產(chǎn)紫花苜蓿根瘤菌的固體粉劑和液體菌劑為研究對象，分別對生產(chǎn)菌劑所需的載體和添加劑、菌劑保存所需的菌劑含水量及保存溫度進(jìn)行研究。結(jié)果表明，生產(chǎn)固體菌劑的最佳載體為含水量10%的高嶺土，添加劑為1.0%的PVP，保存溫度為4 ℃;液體菌劑的添加劑為共同添加1.0%海藻糖、5.0%PVP和10.0%蔗糖最佳。后經(jīng)過結(jié)瘤試驗(yàn)驗(yàn)證，2種劑型都可促使紫花苜蓿高效結(jié)瘤，結(jié)瘤率達(dá)到更高，為95%;紫花苜蓿種子經(jīng)過消毒處理較對照可使單株結(jié)瘤量提高72.4%。通過菌劑接種紫花苜蓿的田間試驗(yàn)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)施加液體菌劑和固體菌劑，紫花苜蓿產(chǎn)量較對照分別提高21.9%和24.2%，結(jié)瘤率分別提高66.7%和67.1%，說明該研究獲得的紫花苜蓿根瘤菌菌劑具有較好的田間增產(chǎn)效果。

關(guān)鍵詞 根瘤菌;紫花苜蓿;劑型;載體;添加劑

Abstract Based on the highefficiency rhizobium strains of Medicago sativa，taking solid powder and liquid bacteria for the production of alfalfa rhizobium as research objects，the carrier，additives，water content of the bacteria needed for the preservation of the bacteria and conserve temperature were studied respectively.The results showed that the best carrier for producing solid bacteria was kaolin with a water content of 10%，the addition of 1.0% PVP，and the 4 ℃ storage temperature;while the addition of 1.0% trehalose，5.0% PVP with ，10.0% sucrose was better for liquid inoculum.After nodulation test verification，both inoculums of rhizobia fertilizer could promote the nodulation rate of the plant，up to 95% in laboratory，in addition，the individual plants increase by 72.4% with sterilized alfalfa seeds inoculating.According to the field test yield statistics of inoculating Medicago sativa with the inoculum，it was found that the yield of Medicago sativa was increased by 21.9% and 24.2%，respectively，compared with the control，and the nodulation rate increased by 66.7% and 67.1%，this confirmed that rhizobia agent of Medicago sativa obtained by this study have efficient yield in farming production.

Key words Rhizobium;Medicago sativa;Inoculant;Carrier;Additives

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科多年生草本植物，根系發(fā)達(dá)，枝葉茂密，含有豐富的粗蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種優(yōu)良的飼用作物[1]。受三聚氰胺事件影響，我國進(jìn)口紫花苜蓿數(shù)量逐年遞增，國際市場競爭力薄弱。隨著2012年中央1號文件提出振興奶業(yè)，發(fā)展紫花苜蓿草業(yè)以來，我國苜蓿草產(chǎn)業(yè)得到了長足發(fā)展[2-3]。

大量研究證實(shí)，施用根瘤菌菌劑可增加紫花苜蓿的結(jié)瘤數(shù)，較其自然生長狀態(tài)可加倍提高紫花苜蓿的結(jié)瘤固氮效率，從而更好地提供生長所需的氮素營養(yǎng)，并同時改善了苜草品質(zhì)。國外種植豆科作物普遍接種根瘤菌菌劑，而我國，由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)落后，紫花苜蓿的種植接種根瘤菌較少，由于苜蓿為低產(chǎn)值作物，因此實(shí)際生產(chǎn)時基本不施用任何肥料，從而造成產(chǎn)量低下的現(xiàn)象[4]。紫花苜蓿和根瘤菌的共生專一性很強(qiáng)，根瘤菌接種劑的效果受當(dāng)?shù)貧夂蚝屯寥拉h(huán)境的影響，往往效果不理想，所謂的廣譜性根瘤菌菌劑是不現(xiàn)實(shí)的。因此因地制宜地研究適合特定土壤的根瘤菌接種劑是解決這一問題的關(guān)鍵。河北省是種植紫花苜蓿大省，一年可刈割4次，但是卻缺乏種植紫花苜蓿的根瘤菌菌劑，據(jù)實(shí)地研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿生產(chǎn)企業(yè)基本不施用根瘤菌接種劑。通過多年紫花苜蓿根瘤菌的篩選研究[5-6]，在河北地區(qū)篩選到一株高效紫花苜蓿根瘤菌菌株——中華草木犀根瘤菌（Sinorhizobia meliloti 848-1，專利號ZL 201510066380.3），該研究以此高效根瘤菌菌株為菌劑生產(chǎn)菌株，擬進(jìn)行紫花苜蓿接種所適宜的劑型——固體菌劑和液體菌劑的生產(chǎn)，對菌劑所需的載體和添加劑、保存溫度及保存的含水量進(jìn)行研究，并最終通過結(jié)瘤試驗(yàn)和菌劑田間試驗(yàn)，驗(yàn)證其施用效果，為河北省的紫花苜蓿生產(chǎn)提供根瘤菌菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。中華草木犀根瘤菌（Sinorhizobia meliloti 848-1，專利號ZL 201510066380.3）。

1.1.2 菌劑載體。采用2種載體進(jìn)行測試，玉米秸稈采自農(nóng)田（后經(jīng)干燥粉碎），高嶺土購自河北省石家莊市靈壽健石高嶺土有限公司。

1.1.3 植物種子。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）中苜一號，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2 試驗(yàn)地概況

田間試驗(yàn)于河北省張家口市北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，年平均氣溫-0.6～9.6 ℃，無霜期80～150 d，日平均氣溫≥10 ℃積溫1 320～3 650 ℃·d;年平均降雨量405 mm，平均日照時數(shù)大約2 700 h;土質(zhì)屬栗鈣土。

1.3 方法

1.3.1 中華草木犀根瘤菌（Sinorhizobia meliloti 848-1）生長曲線的繪制。將經(jīng)活化后的菌株接種在YMA液體培養(yǎng)基（甘露醇10 g/L，酵母粉0.8 g/L，K2HPO4 0.25 g/L、KH2PO4 0.25 g/L、MgSO40.2 g/L、NaCl 0.1 g/L、瓊脂粉14 g/L，pH 6.8～7.2） 中，于28 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取樣測定OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.2 固體菌劑的制作及載體類型的選擇。

載體以高嶺土和玉米秸稈為原料。將玉米秸稈烘干粉碎，過80目篩、烘干;高嶺土烘干，將2種載體（玉米秸稈∶高嶺土）按照5種不同比例（1∶0、1∶3、1∶1、3∶1、0∶1）混勻，之后干熱滅菌備用。取發(fā)酵菌液10 000 r/min離心收集菌體，并用生理鹽水洗滌一次，用pH 7.0磷酸緩沖液懸浮菌體，使加入載體后含水量達(dá)到飽和持水量的10%。將懸浮的菌液注入裝有不同配比的載體袋（20 cm×10 cm）中，混勻封口室溫保存80 d，每隔20 d 抽樣一次，按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對根瘤菌肥料進(jìn)行菌劑活菌數(shù)的測定[7]。

1.3.3 固體菌劑飽和持水量及保存濕度的確定。

選用優(yōu)化后的載體配比，進(jìn)行干熱滅菌，加入磷酸緩沖液使其達(dá)到載體飽和持水量，從而測定各個載體類型的飽和持水量。干燥載體注入菌液后，并設(shè)定3個菌劑含水量梯度：5%、10%、15%（占飽和持水量），密封室溫保存80 d，20 d抽樣一次，并進(jìn)行菌劑活菌數(shù)測定。

載體的飽和持水量（X）計(jì)算公式：X=W3-W2-W1W2×100%，式中，W1為用濾紙將漏斗襯好加入足量蒸餾水讓其自然滲漏至不再滲漏為止，漏斗及濾紙裝置的總重;W2為稱取的載體重量;W3為向稱取的載體中加入足量蒸餾水讓其自然滲漏至不再滲漏為止，此時漏斗及載體等裝置的總重[8]。

1.3.4 固體菌劑保存溫度的確定。

將制作好的菌劑分成兩組，A組在室溫陰涼干燥處保存，B組4 ℃冷藏保存80 d，20 d 抽樣一次，并進(jìn)行菌劑活菌數(shù)測定。

1.3.5 固體菌劑添加劑的選擇。菌劑在保存和應(yīng)用過程中干燥和低溫會使細(xì)胞膜脫水、結(jié)晶造成不可逆的損傷。在載體內(nèi)加入一些添加劑有利于提高菌活數(shù)，延長保質(zhì)期。該研究選擇海藻糖[9]和PVP（聚乙烯吡咯烷酮）[10]2種添加劑分別進(jìn)行不同適宜含量的研究，海藻糖的添加濃度為0.5%、1%和2%，PVP為1%、5%和10%。將加添加劑的固體菌劑在室溫保存80 d，每20 d抽樣一次，并進(jìn)行菌劑活菌數(shù)的測定。

1.3.6 液體菌劑的制作和添加劑的確定。

在液體菌劑中，添加劑的使用可保證其相對穩(wěn)定的菌活數(shù)，所以液體菌劑選擇了4種添加劑（海藻糖、PVP、甘油和蔗糖）進(jìn)行測試，設(shè)置3個濃度水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

配制PBS緩沖液（0.2 mol/L NaH2PO4與0.2 mol/L Na2HPO4按38∶62的比例混勻，加入8 g/L的NaCl），分別添加各種配比的添加劑，加入離心收集的菌體，離心管4 ℃冰箱封口保存80 d，20 d抽樣一次進(jìn)行活菌數(shù)測定。

1.3.7 固體和液體菌劑室內(nèi)接種結(jié)瘤效果驗(yàn)證。

該試驗(yàn)對固體和液體菌劑分別進(jìn)行室內(nèi)接種紫花苜蓿的結(jié)瘤測試，接種的紫花苜蓿種子分消毒和不消毒2種處理，消毒方法為：濃硫酸浸泡5 min，無菌水沖洗5～7次，5%次氯酸鈉處理2 min，無菌水沖洗5～7次后備用。處理或不處理的種子分別用液體菌劑和固體粉劑拌種，對照不接種菌劑然后植入經(jīng)Fahraeus無氮營養(yǎng)液[11]配制的固體瓊脂斜面上。接種后定期觀察植物生長情況，適量添加無氮營養(yǎng)液，保證植物生長水分所需。

將消毒過的種子取出，接種過液體菌劑與固體粉劑的各取20粒，放入100 mL無菌水內(nèi)，搖勻10 min，梯度稀釋，涂布平板，測定液體中的菌活數(shù)，計(jì)算種子平均帶菌量。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)植物結(jié)瘤情況。

1.3.8 菌劑田間接種施用效果研究。

試驗(yàn)組分別施加固體粉劑與液體菌劑，對照組不接種菌劑，每個處理5個重復(fù)，隨機(jī)排列，共15個小區(qū)，每小區(qū)面積為3 m×5 m，小區(qū)間隔離帶寬1 m。播種前，將已經(jīng)制備好的菌劑與中苜一號紫花苜蓿種子拌勻，液體和固體菌劑拌種量分別為1 500 mL/hm2和1 500 g/hm2，條播，行間距30 cm，播種量為11.25 kg/hm2，生長季末，每處理分別隨機(jī)選取50株單株植物統(tǒng)計(jì)結(jié)瘤數(shù)，計(jì)算結(jié)瘤率。將每個小區(qū)按照五點(diǎn)取樣方法，每個點(diǎn)取1 m2，測量植株鮮重。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 13.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并利用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，確定各因子內(nèi)部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華草木犀根瘤菌（Sinorhizobia meliloti 848-1）生長曲線

菌株接種于YMA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 h后，測定培養(yǎng)液OD值，獲得菌株生長曲線如圖1。從菌株848-1的生長曲線可以看出，培養(yǎng)20 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，大約40 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，該研究在對數(shù)期前即40 h時收集菌體。

2.2 固體菌劑載體類型的選擇

確定了不同配比載體的飽和持水量后，將菌劑含水量調(diào)節(jié)到10%，經(jīng)過每隔20 d的為期80 d的活菌數(shù)測定，發(fā)現(xiàn)單一載體高嶺土保存效果最好，80 d后，活菌數(shù)為1.2×107 CFU/g，如圖2所示，與其他配比載體相比，差異極顯著（P<0.01）。

2.3 固體菌劑含水量研究

對保存80 d在不同含水量條件下的固體菌劑5個時期的菌活數(shù)進(jìn)行測定，活菌數(shù)變化趨勢如圖3，在3個不同梯度含水量的條件下，可發(fā)現(xiàn)10%含水量的菌劑菌活數(shù)較好，保存80 d后，活菌數(shù)為6.95×107 CFU/g，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著（P<0.05）。

2.4 固體菌劑保存溫度的確定 對保存80 d在常溫和4 ℃保存下的固體菌劑5個時期活菌數(shù)測定，從圖4可以看出，4 ℃保存較常溫保存菌活數(shù)差異顯著（P<0.05），表明4 ℃的保存效果較常溫（25 ℃）好，80 d后菌劑活菌數(shù)為1.07×108 CFU/g，符合國家對根瘤菌菌劑的要求，可以延長菌劑保質(zhì)期。

2.5 固體菌劑添加劑的選擇

在固體菌劑中加入添加劑后可明顯延長菌劑保存時間，固體菌劑加入不同的添加劑后，每20 d抽樣檢測一次，變化趨勢如圖5，發(fā)現(xiàn)添加劑對菌劑保存效果極顯著（P<0.01），保存80 d活菌數(shù)仍很高，均保持在108數(shù)量級上，最高可達(dá)9.07×108CFU/g。而無添加劑的菌劑，60 d后活菌數(shù)開始迅速下降，80 d后降至1.01×107 CFU/g。但是，2種添加劑的差異不顯著（P>0.05），考慮到商業(yè)生產(chǎn)成本，海藻糖價(jià)格高于PVP，可用PVP來代替海藻糖用于生產(chǎn)，綜上可以初步確定選擇1%的PVP作為固體菌劑的保護(hù)劑。

2.6 液體菌劑添加劑的確定

4種添加劑分別設(shè)置了3種濃度，每20 d抽樣檢測一次，80 d后，根據(jù)各個時段測定的活菌數(shù)，計(jì)算各個時段活菌數(shù)變化的標(biāo)準(zhǔn)差，正交試驗(yàn)結(jié)果如表1。由表1可知，液體菌劑中，同時添加1.0%海藻糖、5.0%PVP、10.0%蔗糖保存效果最好，80 d后活菌數(shù)仍保持在108數(shù)量級上，符合國家根瘤菌菌劑要求。

2.7 2種菌劑室內(nèi)結(jié)瘤效果驗(yàn)證

種子帶菌數(shù)測定結(jié)果（表2）表明，液體菌劑處理的種子帶菌數(shù)明顯高于固體菌劑。接種40 d后，統(tǒng)計(jì)紫花苜蓿植株的結(jié)瘤情況，結(jié)果如表3所示。接種種子的2種處理表明，種子經(jīng)過消毒處理，平均單株結(jié)瘤量提高72.4%;施用液體菌劑與固體菌劑相比，紫花苜蓿單株結(jié)瘤量提高25.7%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著（P<0.05）。

2.8 固體和液體菌劑田間施用效果的測試 生長季末，隨機(jī)取樣并統(tǒng)計(jì)單株結(jié)瘤數(shù)和植物鮮重。由表4可知，施用根瘤菌菌劑對紫花苜蓿的結(jié)瘤數(shù)和植株的鮮重影響顯著（P<0.05）;與對照組相比，施加液體菌劑和固體菌劑后，紫花苜蓿植物分別增產(chǎn)21.9%和24.2%，結(jié)瘤率分別提高66.7%和67.1%。說明施加根瘤菌菌劑可提高苜蓿產(chǎn)量，但施加液體菌劑與固體菌劑間差異不明顯（P>0.05）。

3 討論

3.1 菌劑的制備和保存

制備高質(zhì)量的固體菌劑首要的是選擇合適的載體。高嶺土是非金屬礦產(chǎn)資源，儲量豐富，用途廣泛，將其用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不會產(chǎn)生任何毒副作用。玉米秸稈作為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中一種十分寶貴的生物質(zhì)能資源，價(jià)廉、易得且營養(yǎng)豐富，可作為一種新型環(huán)保載體材料。該研究對比了高嶺土和玉米秸稈制成的各種配比的復(fù)合載體，發(fā)現(xiàn)單一載體高嶺土效果最好，80 d后活菌數(shù)仍有1.2×107 CFU/g，說明高嶺土對菌體有良好的保護(hù)作用，可延長菌劑保存時間，這與田曉麗等[12]在生防菌Fo47菌株和洪永聰[13]在生防菌TL2菌株的菌劑研制結(jié)果一致。而含有玉米秸稈成分的載體均較差，含有玉米秸稈成分的菌劑雜菌污染嚴(yán)重，可能是玉米秸稈營養(yǎng)豐富和可利用的化學(xué)成分多導(dǎo)致。

適當(dāng)?shù)臐穸群捅２販囟葘Ω鼍谋２匾埠苤匾?。通過對固體菌劑不同含水量（5%、10%、15%）和保存溫度（25和4 ℃）的研究發(fā)現(xiàn)，10%含水量的固體菌劑并在4 ℃保藏下保存效果最好，且4 ℃的保存條件不難實(shí)現(xiàn)，可被推廣。

相關(guān)研究證明，在菌劑內(nèi)添加PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、海藻糖、丙三醇、麥芽糖、山梨糖、蔗糖等組分作為保護(hù)劑，能夠提高菌活數(shù)，延長菌劑保質(zhì)期[14-16]。在該研究中，固體菌劑中添加1.0%的PVP，液體菌劑中同時添加1.0%海藻糖、5.0%PVP和10.0%蔗糖，為最佳比例。

3.2 2種菌劑室內(nèi)結(jié)瘤效果和田間施用效果驗(yàn)證

根瘤菌與植物共生固氮受當(dāng)?shù)丨h(huán)境的影響，如環(huán)境溫度、土壤營養(yǎng)、土壤濕度以及酸堿度等[17]，因此研究適合特定環(huán)境的根瘤菌菌劑十分重要。高振生等[18]在黃河三角洲接種紫花苜蓿根瘤菌，紫花苜蓿產(chǎn)量提高50%～93%，結(jié)瘤率提高70.97%～73.39%。寧國贊等[19]在遼寧、黑龍江、云南、江西及內(nèi)蒙等多個試驗(yàn)點(diǎn)給紫花苜蓿接種根瘤菌，平均增產(chǎn)37.8%。喻文虎等[20]在甘肅省高寒陰濕地區(qū)種植紫花苜蓿，接種根瘤菌，增產(chǎn)27%。

河北省是種植紫花苜蓿的大省，但缺乏紫花苜蓿根瘤菌菌劑的應(yīng)用研究。曾昭海等[21]在河北吳橋種植紫花苜蓿并接種3種高效根瘤菌，紫花苜蓿產(chǎn)量分別增加11.9%、10.2%和13.7%，經(jīng)分析是當(dāng)?shù)赝林鼍剂雎势咚?。該研究以在河北地區(qū)篩選的一株高效菌株為菌劑生產(chǎn)菌株，田間試驗(yàn)在河北張家口進(jìn)行，盡管當(dāng)?shù)丨h(huán)境寒冷、干旱，接種高效根瘤菌液體菌劑和固體菌劑后，紫花苜蓿產(chǎn)量仍分別提高21.9%和24.2%，結(jié)瘤率分別提高66.7%和67.1%。說明該研究的菌劑有實(shí)際應(yīng)用效果，試驗(yàn)菌株相對于土著根瘤菌有競爭優(yōu)勢。而施用液體菌劑和固體菌劑間差異不顯著，與室內(nèi)結(jié)瘤試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果不一致，可能是由于實(shí)驗(yàn)小區(qū)土壤的不均一化導(dǎo)致。

4 小結(jié)

此次研究以在河北地區(qū)篩選的一株高效專利菌株為菌劑生產(chǎn)菌株，進(jìn)行了菌劑的制備和保存方法，所得固體菌劑和液體菌劑在保存80 d后，活菌數(shù)均保持在108數(shù)量級上，符合國家根瘤菌菌劑標(biāo)準(zhǔn)。同時田間試驗(yàn)表明，施用根瘤菌菌劑可明顯提高紫花苜蓿產(chǎn)量。該研究可為紫花苜蓿根瘤菌菌劑在河北地區(qū)的推廣提供技術(shù)支持。

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