利用分子標(biāo)記及花藥培養(yǎng)快速改良五山絲苗

徐麗媛　周桂林　馮睿彤　范家萌　周賢達(dá)　周紅英　吳曉亮

摘 要：將五山絲苗/R0356作為親本，使用分子標(biāo)記輔助育種和水稻花藥培養(yǎng)相結(jié)合的方法，僅需2年即得到穩(wěn)定遺傳的與五山絲苗性狀相似且?guī)в邢阄兜幕謴?fù)系材料。具體方法是通過分子標(biāo)記檢測F2代材料，確定單株材料中是否含有香味基因，對含有香味基因的單株在孕穗期取樣進(jìn)行水稻花藥培養(yǎng)，培養(yǎng)過程使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為M8+2.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L KT+60g/L蔗糖+8g/L瓊脂，花藥培養(yǎng)得到的純合二倍體綠苗再進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，將含有香味基因的材料在田間種植，經(jīng)過篩選后即得到優(yōu)質(zhì)的改良五山絲苗（HPR10）。

關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記檢測;花藥培養(yǎng);恢復(fù)系選擇;香味

中圖分類號 S511文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）12-0014-03

Abstract： With the combination of molecular marker assisted breeding and rice anther culture， it takes only 2 years to get the restorer line materials with stable genetic characteristics similar to wushansimiao / r0356 as parents. The specific method is to detect F2 generation materials by molecular markers to determine whether there is fragrance gene in the single plant materials. The single plant with fragrance gene is sampled at booting stage for rice anther culture， and the induction medium used in the culture process is M8+2.0mg/l 2，4-D+1.0mg/l KT+60g/L sucrose+8g/L agar， The pure diploid green plantlets obtained from anther culture were detected by molecular markers， and the materials containing fragrance genes were planted and propagated in the field. After screening， the high quality improved wushansimiao（hpr10） were obtained.

Key words： Molecular marker detection; Anther culture; Restoration line selection; Fragrance

中國是世界上最大的水稻生產(chǎn)和消費(fèi)國，雜交水稻的成功選育，為保障國家糧食安全供給做出了巨大的貢獻(xiàn)[1]。近年來，隨著生活質(zhì)量的提高，國民對稻米食味品質(zhì)的需求有所提高，給育種工作帶來了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)[2]。

傳統(tǒng)的育種手段對優(yōu)質(zhì)材料的純化效率偏低，1個材料需要4～5年才能選育出純合材料。水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)利用花藥誘導(dǎo)愈傷分化獲得單倍體綠苗，單倍體綠苗DNA加倍后即得到純合二倍體材料，這種方法能夠縮短育種時間，加快育種速度。但在實際操作過程中，有很多因素影響培養(yǎng)效果[3-4]。

作為高品質(zhì)稻米的一個重要特性，含有香味特性的稻米更受市場青睞。在稻米香味的選育過程中，直接有效的方式是對水稻香味基因進(jìn)行檢測?，F(xiàn)在水稻全基因組序列已經(jīng)明確，香味功能基因的分子標(biāo)記已經(jīng)比較成熟[6-7]。通過分析得到與香味基因緊密連鎖的分子標(biāo)記基因，可以直接進(jìn)行檢測[8]。在其他農(nóng)藝性狀不變的前提下對恢復(fù)系進(jìn)行改良，變成食味品質(zhì)更佳的材料，對于推動農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要的意義[9]

本研究對恢復(fù)系進(jìn)行了快速改良，將分子標(biāo)記輔助選擇、水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)與傳統(tǒng)的育種手段結(jié)合，在育種的低世代獲得含有目的基因的純合材料，以期縮短育種周期，提高育種效率[10]。

1 材料與方法

1.1 供試材料 供試材料：五山絲苗、R0356。五山絲苗的株型較緊湊、抗倒力中強(qiáng)、成穗率高;R0356的株高較高、劍葉挺、粒型細(xì)長、含有香味，但莖稈較細(xì)，抗倒性弱。所有材料均由合肥豐樂種業(yè)股份有限公司水稻研究院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 分子標(biāo)記檢測 水稻苗期，在田間取葉片進(jìn)行檢測，使用DNA快速提取方法獲取樣品DNA溶液[11]。多態(tài)性標(biāo)記引物GRFM04[12]序列為F：GTTAGGTTGCATTTACTGGGAG，R：GAATGATGCTCAA AGTGTCT，擴(kuò)增體系為：DNA提取液2.0μL、10 x Buffer 1.0μL、dNTP 0.8μL、引物0.5μL、Taq酶0.1μL和ddH2O 5.6μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2min;35個循環(huán)：①變性94℃，15s，②退火55℃，15s，③延伸72℃，30s;72℃延伸5min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用4%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.2.2 水稻花藥培養(yǎng) 取材時選擇處在單核靠邊期的花粉，目測處于水稻劍葉與倒二葉葉枕距5～8cm時，接種過程使用剪穎抖藥法。培養(yǎng)過程采用3步培養(yǎng)法：誘導(dǎo)培養(yǎng)時以M8為基本培養(yǎng)基，配合多種激素，具體激素添加量如表1所示;分化培養(yǎng)時以MS為基本培養(yǎng)基;生根培養(yǎng)時以1/2MS為基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基pH均為5.8。

1.3 選育過程 2017年8月，豐樂種業(yè)蘇小水稻基地利用五山絲苗/R0356構(gòu)建群體，同年12月，海南種植BC1F1群體，去除假雜種，其余種子混合收獲。2018年5月，在F2代中選取3個較好的株系命名為CR1、CR2、CR3，每個株系群體種植1000株，苗期取單株葉片進(jìn)行基因檢測分析，對檢測到含有香味基因的材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)得到H0代幼苗，同年12月將培養(yǎng)出的H0代幼苗移栽至三亞種植。田間種植后，對結(jié)實較好的正常苗進(jìn)行取材，寄回合肥進(jìn)行香味基因的檢測，收獲含有香味基因的H1代材料單穗。2019年5月，在合肥種植H1，并進(jìn)行配合力測定。2019年12月進(jìn)行了三亞比較試驗，篩選得到符合目標(biāo)性狀的H2代株系并進(jìn)行選擇和進(jìn)一步利用。選育流程如圖1所示。[2017年08月 五山絲苗/R0356 合肥-構(gòu)建群體

2017年12月 F1 三亞-去假雜種，混收2018年5月 F2 合肥-種植群體，選取三個較好的株系，單株檢測，花藥培養(yǎng)2018年12月 H0 三亞-種植花培苗，檢測香味基因，單穗收2019年5月 H1 合肥-株行種植，配合力測定2019年12月 H2 三亞-篩選、利用 ]

2 結(jié)果與分析

2.1 改良群體分子標(biāo)記檢測結(jié)果 對每個群體所有單株（共1000個）進(jìn)行檢測，CR1、CR2、CR3分別得到137、164、121個含有香味基因的單株，部分分子檢測電泳圖譜見圖2。圖2所示為CR1株系1-90號單株檢測電泳圖譜，其中CK為含有目的基因的條帶。由圖2可知，CR1材料1～90號單株中，有14個單株的帶型與CK帶型相同，分別為3、7、10、21、25、31、37、38、39、56、57、58、59、60。將這些編號的材料在田間找出并標(biāo)注，在合適時期取材進(jìn)行花藥培養(yǎng)。

2.2 影響水稻花藥培養(yǎng)的因素 水稻花藥培養(yǎng)過程中，愈傷組織誘導(dǎo)率受取材時間和誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方2個因素的影響較大。

2.2.1 不同取材時間對誘導(dǎo)效果的影響 愈傷組織生成數(shù)統(tǒng)計日期為轉(zhuǎn)接花藥后第75天，轉(zhuǎn)接花藥數(shù)目統(tǒng)計按照每個單株轉(zhuǎn)接2瓶，每瓶轉(zhuǎn)接50枚花藥計算。通過表中的數(shù)據(jù)可以看到，不同取材時間的誘導(dǎo)率不同，CR1在7月27日取材時誘導(dǎo)率最低，隨后逐漸上升，8月16日取材時誘導(dǎo)效率最高，CR2在7月27日所取材料得到最高的誘導(dǎo)率，隨后逐漸降低，CR3在7月27日和8月16日取材的誘導(dǎo)率較低，8月6日取材的誘導(dǎo)率最高。由于不能對每個細(xì)胞都進(jìn)行鏡檢，不同材料的單株狀態(tài)并不完全相同，同一株系內(nèi)水稻單株又具有不同的分蘗。經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，需要多次對同一材料進(jìn)行田間取材，才能夠得到較高的誘導(dǎo)率。

2.2.2 不同激素對誘導(dǎo)花藥愈傷組織效果的影響 從圖3可以看出，3種配方誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織個數(shù)，培養(yǎng)基B在3個材料上均表現(xiàn)出低誘導(dǎo)率，培養(yǎng)基C在3個材料上均表現(xiàn)出高誘導(dǎo)率，因此在培養(yǎng)過程中使用培養(yǎng)基C進(jìn)行培養(yǎng)能夠獲得更多的愈傷組織。

2.3 改良效果 經(jīng)過花藥培養(yǎng)，共生成330株綠苗，將綠苗從培養(yǎng)基中取出，洗凈根系后移栽種植。移栽到大田時用遮陽網(wǎng)蓋住，防止弱苗被陽光直射導(dǎo)致死苗，7d后綠苗葉片舒展，施少許復(fù)合肥使其快速生長，根據(jù)綠苗長勢選擇需要的單株，將未加倍的單倍體、結(jié)實差和農(nóng)藝性狀不好的單株去除，留取符合育種目標(biāo)的單株進(jìn)行單穗收獲，第2季將單穗進(jìn)行株行種植，后期進(jìn)一步觀察。目前，通過該技術(shù)選擇得到30個含有香味的穩(wěn)定株系，經(jīng)過一系列田間比較試驗，最終篩選得到優(yōu)質(zhì)改良恢復(fù)系HPR10。該材料與五山絲苗相似，但導(dǎo)入了R0356的香味基因，含有香味，配合力更好、株高適中、分蘗強(qiáng)、抗倒性較強(qiáng)。

3 討論

由于秈稻花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率的高低受基因型的影響較大，針對不同材料需找到適合的培養(yǎng)方法。由于愈傷誘導(dǎo)后期的分化培養(yǎng)階段均使用常規(guī)MS培養(yǎng)基，本文僅對誘導(dǎo)愈傷組織階段培養(yǎng)基進(jìn)行改良，通過試驗得到了一種對該材料實用性較高的配方，并且采取一個株系多次取材的方法，保證材料其有較高的愈傷組織誘導(dǎo)率。

由于當(dāng)前分子標(biāo)記檢測的費(fèi)用較低，且操作簡便，可對所有需要檢測的材料都進(jìn)行檢測。本試驗經(jīng)檢測結(jié)果僅有14%的單株含有香味基因，通過檢測增加了選取材料的精確度，減輕了田間育種工作量。

與其他育種材料相比，改良恢復(fù)系的可利用價值更高，分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的快速發(fā)展，為育種單位縮短育種年限、提高育種效率提供了切實可行的途徑。本研究針對性的將田間育種、分子標(biāo)記輔助選擇、水稻花藥培養(yǎng)3種方法進(jìn)行結(jié)合，充分利用現(xiàn)代科技手段，快速改良恢復(fù)系并得到了預(yù)期材料。

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（責(zé)編：張宏民）