美國白蛾熱激蛋白家族基因的篩選與鑒定

楊廣生　張?zhí)m　張猛　陳琪

摘 要：熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）一般是指生物體遇到極端環(huán)境時大量表達(dá)的一類高度保守基因，在昆蟲的抗逆性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。以世界性入侵害蟲美國白蛾（Hyphantria cunea）基因組數(shù)據(jù)為依據(jù)，對白蛾的HSP家族基因進(jìn)行篩選與鑒定。結(jié)果表明：美國白蛾體內(nèi)共有20個HcunHSPs，包括8個HSP20s、7個HSP40s、4個HSP70s和1個HSP90;結(jié)合美國白蛾12個轉(zhuǎn)錄組中上述HSPs的表達(dá)量及鱗翅目中已有相關(guān)基因的功能研究，對HcunHSPs功能進(jìn)行了初步預(yù)測。研究結(jié)果可為后期對美國白蛾抵抗逆境脅迫機(jī)制研究提供分子理論基礎(chǔ)，為針對美國白蛾的綠色防控提供基因靶標(biāo)和新思路。

關(guān)鍵詞：美國白蛾;熱激蛋白;基因組;轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號 S763.42文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）12-0010-04

熱激蛋白（HSP）又名應(yīng)激蛋白或分子伴侶，廣泛分布于真原核生物中，通常在細(xì)胞或生物體遇到極端環(huán)境如高溫、寒冷、缺氧、UV輻射、擁擠、傷口愈合和組織重建時發(fā)揮作用[1-4]。根據(jù)HSP在生物體內(nèi)的表達(dá)情況可被分為組成型HSP和誘導(dǎo)型HSP[5]。前者在生物體常態(tài)即大量表達(dá)，對外界脅迫不敏感，主要參與生物體的生長發(fā)育;后者常作為分子伴侶發(fā)揮作用，通常情況下不表達(dá)或低表達(dá)。在昆蟲中，當(dāng)蟲體遇到脅迫刺激時，誘導(dǎo)型HSP可通過上調(diào)表達(dá)量，與異常蛋白結(jié)合幫其重新折疊，避免細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)損傷嚴(yán)重，從而起到保護(hù)昆蟲免受環(huán)境刺激的影響。目前最被相關(guān)學(xué)者認(rèn)可的是根據(jù)熱激蛋白的分子量（kDa）大小進(jìn)行分類，一般可被分為HSP90、HSP70、HSP60以及小分子熱激蛋白（small heat shock protein，sHSP，蛋白質(zhì)分子量低于50kDa的熱激蛋白，常包括HSP20、HSP40）等4類[6]。

美國白蛾（Hyphantria cunea），又名秋幕毛蟲、秋幕蛾，隸屬鱗翅目（Lepidoptera）、燈蛾科（Arctiidae）、白蛾屬（Hyphantria），是一種取食范圍極廣的世界性重要入侵害蟲，其大量暴發(fā)時受害樹木部分樹冠被網(wǎng)幕覆蓋，樹葉全部被食光，可對森林生態(tài)系統(tǒng)造成毀滅性破壞。目前，美國白蛾的基因組和不同組織與齡期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)公布，為本次研究提供了有利基礎(chǔ)。

筆者借助美國白蛾基因組的基因注釋信息和NCBI-Blastp，對其熱激蛋白家族基因進(jìn)行了篩選與鑒定，并結(jié)合不同組織和齡期中熱激蛋白基因的表達(dá)量變化對其功能進(jìn)行初步分析。通過對美國白蛾體內(nèi)熱激蛋白的篩選與鑒定，為后期研究美國白蛾適應(yīng)環(huán)境變化及應(yīng)對極端環(huán)境的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為開發(fā)綠色防控基因靶標(biāo)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究材料 主要利用美國白蛾基因組和12個不同齡期和組織的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[7]，包括：（1）不同齡期：卵、2齡幼蟲、4齡幼蟲、蛹以及雌雄全蟲;（2）不同組織：頭、胸、腿、腹、觸角和雌蟲性腺。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)主要利用美國白蛾熱激蛋白家族基因在12個轉(zhuǎn)錄組樣本的表達(dá)量數(shù)據(jù)FPKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）。

1.2 研究方法

1.2.1 美國白蛾HSP家族基因篩選 借助美國白蛾已發(fā)表的基因組注釋信息[7]，以Heat shock protein和HSP作為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)基因信息，并在基因組測序結(jié)果中將對應(yīng)基因的核苷酸序列整理出來。利用在線翻譯工具ExPASy（https：//web.expasy.org/translate/）將初篩得到的美國白蛾HSP家族基因核苷酸序列翻譯為氨基酸。

1.2.2 美國白蛾HSP家族基因鑒定 利用NCBI中的Blast對在基因組中初篩得到的HcunHSPs家族基因的氨基酸進(jìn)行在線同源比對，查看Query cover和Ident值均較高的基因序列信息，對美國白蛾HSP家族基因進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。其中Query cover表示所比對序列與目標(biāo)序列的覆蓋度，Ident表示所比對序列與目標(biāo)序列的相似度。兩者均以百分比表示，百分?jǐn)?shù)越大，基因之間相似度越高。

1.2.3 美國白蛾HSP家族基因功能初步預(yù)測 借助美國白蛾12個不同齡期與組織的基因表達(dá)信息FPKM值[7]，比較美國白蛾HSPs家族基因在樣本中的表達(dá)情況，關(guān)聯(lián)該時期或組織的功能特點(diǎn)，并結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于該HSP已有功能研究，對美國白蛾HSPs的功能進(jìn)行初步預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 美國白蛾HSP家族基因 在美國白蛾基因組注釋信息中，共篩選到29條與HSP相關(guān)的序列信息，其中有9條為不符合篩選目的的序列，包括HSP-binding protein、分子量大小不符合以及經(jīng)過NCBI-Blast后同源性極低的序列。經(jīng)過濾不符合要求的信息后，共獲得20個美國白蛾HcunHSP家族基因（見表1），包括：8個HSP20s、7個HSP40s、4個HSP70s和1個HSP90。此外，鑒定得到的HcunHSP70中，有3個HcunHSP70（Gene ID分別為：EVM0013579、EVM0003299、EVM0000698）均包含已報道的HSP70特有序列IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、VVLVGGSTRIP[5]。HcunHSP90（Genen ID：EVM0012516）包含了YSNKEIFLRE、LGTIAKSGT、IKLYVRRVFI、GVVDSEDLPLNISR 4條HSP90特有序列[5]。7個HcunHSP40基因均為DnaJ homolog，且均與家蠶（Bombyx mori）的BmorDnaJ （HSP40）同源性匹配度高，除了EVM0001102（與BmorDnaJ （HSP40）homolog 9比對結(jié)果覆蓋度達(dá) 99%），其他6個HcunHSP40與家蠶不同的BmorDnaJ （HSP40）的NCBI-Blast比對結(jié)果中的覆蓋度均達(dá)到了100%（見表1），相似度極高。研究表明HSP20保守性較差，所以8個HcunHSP20在NCBI中比對結(jié)果相對于其他HcunHSPs的同源比對結(jié)果中，覆蓋度和相似度偏低，但仍具有一定的相似性。

2.2 美國白蛾HSP家族基因的表達(dá)量及功能 借助美國白蛾12個樣本的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中美國白蛾HSP家族基因的表達(dá)量（FPKM）信息（見表2、3），結(jié)果顯示相同HcunHSP在不同樣本和不同HcunHSPs在相同樣本中的表達(dá)差異均很大。

在HcunHSP20s中，基因EVM0013517與EVM0003954在不同齡期中的表達(dá)趨勢相似，均在雌成蟲中表達(dá)量最高，但在不同組織中，兩者分別在胸部組織和性腺中表達(dá)量最高。異色瓢蟲中（Harmonia axyrides）的HaxyHSP21.53也是在成蟲期表達(dá)量達(dá)到最高，在瓢蟲生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[8]，因此推測HcunHSP20中的上述2個基因可能也與美國白蛾的生長發(fā)育具有重要聯(lián)系，且EVM0003954主要在雌成蟲性腺中表達(dá)，可能對性腺功能有重要影響，推測屬于組成型HSP，或可應(yīng)用于美國白蛾防治的基因靶點(diǎn)?，F(xiàn)有研究一般認(rèn)為HSP20主要作為昆蟲應(yīng)對高溫脅迫時發(fā)揮響應(yīng)的分子伴侶，如抑制紅尾肉蠅（Sarrcophaga crassipalpis）的HSP23表達(dá)會降低其非滯育蛹的耐熱性[9]。

在HcunHSP40s中，EVM0002427和EVM0010789在卵塊中表達(dá)量較高，可能參與美國白蛾卵的抗性反應(yīng);EVM0001102在成蟲期表達(dá)較高，且在不同組織中表達(dá)差異不大。HSP40目前被證實在昆蟲遇到缺氧刺激時可參與維持細(xì)胞中蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，主要作為幫助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶。也有研究發(fā)現(xiàn)HSP40參與家蟋蟀落翅型翅二型的分化[10]。研究篩選得到的HcunHSP40s與鱗翅目中模式昆蟲家蠶的BmorHSP40s的同源性較高，推測其功能可能與其相似，可能參與美國白蛾的抗逆和抗病過程[11]。

在HcunHSP70中，EVM0013579在12個樣本中均未檢測到表達(dá)，推測該基因可能不表達(dá)或響應(yīng)極端環(huán)境刺激才會有所表達(dá)，與草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）SfruHSP70同源性較高，而研究表明SfruHSP70參與ATP-binding（https：//www.uniprot.org/uniprot/Q8I866）;EVM0003299基因僅在美國白蛾卵塊和觸角中檢測到表達(dá)，但表達(dá)量均比較低，該基因與斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的SlitHSP70同源性較高，研究表明SlitHSP70響應(yīng)鋅脅迫[12]。EVM0000698僅在美國白蛾腹部中有表達(dá)且不高，該基因也與SlitHSP70具同源性（見表1），在S. litura中，SlitHSP70在中腸中表達(dá)，但在脂肪體中表達(dá)量最高。上述3個基因是檢測到3條HSP70特有序列的3個基因，是典型的HSP70。EVM0001158在不同齡期和組織中表達(dá)量差異不大，推測該基因表達(dá)于美國白蛾線粒體中，現(xiàn)有研究表明線粒體熱激蛋白主要參ATP-binding和Nucleotide-binding。

在HcunHSP90中，EVM0012516在不同齡期和組織中均有表達(dá)，且在卵中表達(dá)量最高（FPKM=1232.52832）。HSP90被認(rèn)為是真原核生物中含量豐富的蛋白之一，無論是否遇到脅迫，都是真核生物必不可少的蛋白[13]，可見HSP90功能強(qiáng)大且廣泛，而HcunHSP90與黃野螟（Heortia vitessoides）HvitHSP90同源性最高，但HvitHSP90功能研究較少。在鱗翅目昆蟲中，HSP90主要參與昆蟲的生長發(fā)育、滯育和抗病過程[11]。因此，推測HcunHSP90也與美國白蛾的相應(yīng)功能有關(guān)。

3 小結(jié)

熱激蛋白一直是真原核生物中關(guān)注的熱點(diǎn)基因。在昆蟲中，因其在不同物種中的高度保守性，已成為分析物種進(jìn)化的重要參考;因其響應(yīng)環(huán)境刺激表達(dá)量快速上調(diào)，已成為環(huán)境監(jiān)測工作中常用指標(biāo);因其主要參與昆蟲抗逆反應(yīng)，通過抑制HSP表達(dá)可降低蟲體的抗逆性從而達(dá)到防治害蟲的目的。美國白蛾作為一種危害性強(qiáng)而廣的世界入侵害蟲，從其HSP基因入手，將為研發(fā)綠色有效的監(jiān)測和防控新手段提供基因靶標(biāo)。研究篩選得到的HSP20（EVM0003954）、HSP40s（EVM0002427和EVM0010789）、HSP70（EVM0001158）、HSP90（EVM0012516），將可為后期的相關(guān)研究提供重要的分子理論研究基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：徐世紅）