花青素合成轉(zhuǎn)錄因子PAP2植物表達載體構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化

段真珍　黃振　周宇明　李慧雪　涂萬富　張木清　姚偉

摘要 AtPAP2基因是擬南芥花青素生物合成途徑中的重要調(diào)控基因，為了實現(xiàn)該基因在煙草中的高效表達，從擬南芥中分離克隆出了AtPAP2基因并構(gòu)建了植物表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染方法，將該基因成功轉(zhuǎn)入到煙草受體材料中，并獲得了紫色的轉(zhuǎn)基因煙草植株，相對于野生型煙草，該煙草在根、莖、葉等組織上均表現(xiàn)出不同程度的紫色。進一步的qRT-PCR分析結(jié)果表明，在花青素生物合成途徑中，AtPAP2基因的表達可以上調(diào)從4-香豆酰CoA到最終合成花青素過程中的相關(guān)基因，促進了合成反應(yīng)的進行，對花青素的合成具有重要的作用。該研究對于揭示AtPAP2基因的作用以及煙草花青素合成途徑相關(guān)基因的調(diào)節(jié)機理具有重要的意義。

關(guān)鍵詞 煙草;花青素;轉(zhuǎn)錄因子;轉(zhuǎn)基因

中圖分類號 Q943.2文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）13-0106-05

Abstract The AtPAP2 gene is a regulatory gene in the anthocyanin synthesis pathway of Arabidopsis thaliana，in order to express this gene in tobacco， we successfully cloned the AtPAP2 gene from A. thaliana and constructed into a plant expression vector. We successfully transferred this gene into tobacco by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation， and achieved the purple phenotype transgenice tobacco plants.Compared with the wild type tobacco plant， the transgenic tobacco plants showed different degree of purple color in root，stem and leaf. qRTPCR analysis showed that the expression of AtPAP2 gene in tobacco significantly upregulated the related genes from 4coumaroylCoA to anthocyanins， and promoted the synthesis of anthocyanins. This research is of great significance to reveal the role of AtPAP2 gene and reveals the regulation mechanism of anthocyanin biosynthesis pathwayrelated genes in tobacco.

Key words Tobacco;Anthocyanin;Transcription factor;Transgenic plant

花青素是一類在植物中廣泛存在的次級代謝產(chǎn)物，屬于黃酮類物質(zhì)[1-2]。在自然界中花青素賦予了花草、樹木多彩繽紛的顏色，有助于其吸引各種昆蟲媒介進行授粉、種子傳播[3]，同時，花青素在植物抵抗各種逆境脅迫等方面也具有較為重要的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，花青素在治療心臟病和癌癥，清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面具有重要療效[4]，因而關(guān)于花青素的研究也越來越受人們的重視。

目前，花青素生物合成途徑已經(jīng)在模式植物中研究得較為清楚，苯丙氨酸是花青素合成的直接前體物質(zhì)[1]，在不同基因的調(diào)控下，經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)最終合成各式各樣的花青素。花青素在植物體內(nèi)的合成主要受到兩類基因的調(diào)控，一類是結(jié)構(gòu)基因，可以編碼合成各種酶類，另一類是調(diào)節(jié)因子，調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的合成[5]。目前，花青素合成相關(guān)的主要的酶及其編碼基因在一些植物中已被成功分離和鑒定，如擬南芥、玉米、金魚草、蘋果、矮牽牛等。調(diào)控結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子在很多植物中也被成功分離和鑒定[6]，這些調(diào)節(jié)因子主要包含3個基因家族，R2R3 MYB家族、bHLH家族和WD40家族[7-8]。這些調(diào)節(jié)因子主要是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因在特定時間和空間的表達，調(diào)節(jié)各類次級代謝產(chǎn)物的發(fā)生，對植物生理生長具有重要的意義。

異位表達是研究花青素調(diào)節(jié)因子在植物花青素合成過程中所行使的具體功能的一個方法。煙草是一種常用的模式生物，在煙草中轉(zhuǎn)入相應(yīng)的花青素合成的調(diào)節(jié)因子進行異位表達，可提高葉、花或種子中花青素的含量，獲得可視的植物表型。AtPAP2 基因[9]是R2R3 MYB家族中的一員，最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥中，該基因具有一個完整的開放閱讀框，可編碼249個氨基酸。該研究擬從擬南芥中分離克隆AtPAP2基因并構(gòu)建高效的植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將AtPAP2基因轉(zhuǎn)入到煙草中，培養(yǎng)獲得紫色的煙草，并利用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)AtPAP2基因煙草中花青素合成相關(guān)基因的表達量變化，初步解析AtPAP2基因在花青素合成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用野生型煙草（Nicotiana tabacum cv.xanthinc）無菌苗、野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana Col-0）幼苗、大腸桿菌菌株（DH5α）和農(nóng)桿菌菌株（EHA105）均由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室保存，植物表達載體pGNP由美國康涅狄格大學(xué)植物學(xué)系惠贈。

RNAprep Pure Plant Kit和植物基因組DNA提取試劑盒購自美國Qiagen生物公司;Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和2×Taq PCR Mix均購自美國Roche生物公司;pMD18-T simple載體和SYBR Premix Ex TaqTM購自大連寶生物公司;質(zhì)粒DNA提取試劑盒和DNA膠回收純化試劑盒購自美國Qiagen生物公司;T4 DNA連接酶購自美國Promega公司;Murashige & Skoog（MS）Basal Medium w/ Vitamins購自PhytoTechnology公司;其他試驗所用試劑均為進口或國產(chǎn)分析純?；蛐蛄袦y定和相關(guān)引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成。

煙草遺傳轉(zhuǎn)化所采用的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+ 6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;分化培養(yǎng)基（含抗生素）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Kan 75 mg/L+Timentin 150 mg/L;生根培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基;懸浮培養(yǎng)基：液體MS培養(yǎng)基;以上培養(yǎng)基均含有蔗糖30 g/L，瓊脂0.7 g/L（懸浮培養(yǎng)基除外），pH 5.8～6.0，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，除暗培養(yǎng)步驟外，煙草遺傳轉(zhuǎn)化過程中其他步驟均在光照下（12 h/d）培養(yǎng)，光照強度1 000～2 000 lx。

1.2 擬南芥葉片總RNA提取和AtPAP2基因的克隆

根據(jù)GenBank公布的擬南芥AtPAP2基因（登錄號為AF325124）序列信息，在開放閱讀框兩側(cè)設(shè)計一對特異性擴增引物，命名為pPAP2-F/R，用以擴增目的基因片段（表1）。

參照美國Qiagen生物公司的RNA提取試劑盒說明書，提取長勢良好的擬南芥葉片組織的總RNA，用NanoDrop 2000測定RNA的濃度與純度。取1 μg RNA為模板，采用美國Roche生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以擬南芥cDNA為模板，利用pPAP2-F/R引物進行PCR擴增獲取目的基因。PCR反應(yīng)體系為cDNA 1.0 μL、dNTP 2.0 μL、2×Taq PCR Mix 10.0 μL、pPAP2-F（10 mmol/L）05 μL、pPAP2-R（10 mmol/L）0.5 μL，用ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取1.0 μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測。同時，利用DNA膠回收試劑盒切膠回收并純化目的條帶，連接至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布到含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，獲得單克隆進行PCR檢測，將陽性克隆送去南京金斯瑞生物公司進行測序驗證，命名為pMD18-PAP2。

1.3 植物表達載體的構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

參考美國Qiagen生物公司的質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明提取pMD18-PAP2和植物表達載體pGNP的質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶BstXI和KpnI進行雙酶切反應(yīng)。利用膠回收純化試劑盒分別純化相應(yīng)的質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，并在T4 DNA連接酶作用下進行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布至100 mg/L卡那霉素的LB平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。挑取單克隆并利用菌液PCR進行驗證后，將陽性轉(zhuǎn)化子送南京金斯瑞生物公司進行測序。選擇經(jīng)測序驗證序列正確的菌液保存并提取重組質(zhì)粒DNA，命名為pGNP-PAP2，利用液氮凍融法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞，隨機挑取單克隆利用PCR進行驗證，擴增引物pPAP2-F和pPAP2-R序列見表1。

1.4 煙草遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的篩選鑒定

剪取數(shù)十片無菌煙草組培苗葉片，用刀片切成0.5 cm×0.5 cm小葉片，置于預(yù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d。取含有pGNP-PAP2的EHA105農(nóng)桿菌劃線接種至LB固體培養(yǎng)基（Kan 100 mg/L），28 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落并接種到50 mL的LB液體培養(yǎng)基中（Kan 100 mg/L），28 ℃下振蕩培養(yǎng)12～16 h至OD600約為0.5，經(jīng)擴大培養(yǎng)4～6 h至OD600約為0.6后低速離心棄上清，用等體積的懸浮培養(yǎng)基重懸菌體。將預(yù)培養(yǎng)的葉片置于重懸菌液10～15 min后取出，接種至分化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，直至長出愈傷并分化出叢生芽，將叢生芽剪下轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至長成完整的植株。利用植物基因組DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因煙草小苗葉片總DNA，以pPAP2-F和pPAP2-R為引物進行PCR檢測，驗證AtPAP2基因是否整合到煙草基因組DNA上。

1.5 qRT-PCR分析花青素合成相關(guān)基因的表達差異

煙草的花青素是以苯丙氨酸為前體物質(zhì)，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)而合成的，其間受到編碼各類酶合成結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控（圖1）[10]。該試驗從中選取7個基因，設(shè)計合成qRT-PCR的引物（表1），內(nèi)參基因選取Elongation factor 1α（EF-1α），GenBank序列號為AF120093。參照“1.2”中植物葉片總RNA提取方法，分別提取紫色轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成得到cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR，通過與野生型煙草比較，分析轉(zhuǎn)AtPAP2基因紫色煙草中7個基因表達量的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥葉片總RNA提取和AtPAP2基因的克隆

利用RNA提取試劑盒從擬南芥的葉片中提取總RNA（圖2A），以表1中pPAP2-F和pPAP2-R為特異性引物，擬南芥總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，通過PCR擴增獲得了AtPAP2基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，獲得的目的基因條帶約為750 bp，與預(yù)期AtPAP2基因大小一致（圖2B）。將目的條帶進行切膠回收純化后，連接至T/A克隆載體pMD18-T，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。隨機挑取單克隆進行菌落PCR驗證后，對陽性克隆繼續(xù)測序驗證，將測序結(jié)果通過SnapGene Viewer生物學(xué)軟件進行分析，結(jié)果表明克隆的目的片段大小為750 bp，與GenBank中AtPAP2基因序列完全一致，含有AtPAP2完整的編碼序列，命名為pMD18T-PAP2，可用于下一步的植物表達載體構(gòu)建。

2.2 植物表達載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌

根據(jù)圖3所示的植物表達載體圖譜進行載體構(gòu)建。先提取pMD18T-PAP2菌液的質(zhì)粒DNA，與植物表達載體pGNP的質(zhì)粒DNA同時用限制性內(nèi)切酶BstXI和KpnI進行酶切，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分別切膠純化回收AtPAP2目的片段和pGNP載體的大片段（圖4）。利用T4 DNA連接酶進行連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布至含有卡那霉素抗性的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

隨機挑取單菌落進行菌落PCR驗證，篩選出的陽性克隆命名為pGNP-PAP2。利用液氮凍融法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 EHA105感受態(tài)細胞中，挑取單菌落進行菌落PCR檢測（圖5），將檢測為陽性的菌液送往公司測序，結(jié)果表明AtPAP2基因已經(jīng)完整構(gòu)建至植物表達載體，并成功轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105中，可以用于下一步植物受體材料的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得及其表型觀察

用含有pGN-PAP2的農(nóng)桿菌EHA105侵染煙草葉片，置于含有抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)約15 d，可以看到葉片周圍有紫色的抗性愈傷組織出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)10～15 d即可分化出紫色的叢生芽。待紫色抗性叢生芽長出葉片，將其接種至含抗生素的生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，5～7 d開始生根，繼續(xù)培養(yǎng)20 d左右煙草幼苗可長至5～10 cm高，可將其移栽至土壤中。提取紫色抗性轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組DNA，利用表1中特異性引物pPAP2-F和pPAP2-R對其進行PCR檢測，結(jié)果顯示表現(xiàn)為紫色的抗性煙草苗均能夠擴增出750 bp的AtPAP2基因序列（圖6），證實了該外源基因已經(jīng)整合進入煙草基因組。

通過培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，相對于野生型煙草，紫色的轉(zhuǎn)基因煙草僅在植株葉片、莖和根等器官的顏色上存在差異，在其生長速度、生長狀態(tài)及開花結(jié)實特性等方面均表現(xiàn)為完全一致，進一步表明AtPAP2基因在轉(zhuǎn)基因煙草中可以過量表達，從而使轉(zhuǎn)基因煙草呈現(xiàn)出紫色（圖7 A～G）。

2.4 AtPAP2對煙草花青素合成相關(guān)基因的影響

作為植物類黃酮合成途徑的一個分支途徑，花青素的生物合成已經(jīng)在模式植物中進行了較多研究。研究結(jié)果表明花青素合成的前體物質(zhì)是苯丙氨酸，在一系列基因的調(diào)控下，苯丙氨酸經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)最終形成花青素。為了研究擬南芥

AtPAP2基因在煙草植株中的表達情況，該研究提取了轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總RNA，利用實時熒光定量PCR方法，對選取的花青素合成通路上的7個基因進行檢測，用于分析轉(zhuǎn)基因煙草植株中AtPAP2基因的表達對花青素合成通路的影響[11]。qRT-PCR結(jié)果表明，在花青素合成的前期，即從苯丙氨酸到4-香豆酰CoA的過程中，AtPAP2基因影響作用并不明顯，只是有限上調(diào)了NtPAL基因和有限下調(diào)了Nt4CL基因的表達。但是在從4-香豆酰CoA到花青素合成的過程中，轉(zhuǎn)AtPAP2基因植株中的NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtDFR、NtANS基因表

現(xiàn)出了明顯的上調(diào)表達，與野生型的表達量差異達到數(shù)十倍，極大地促進了該過程一系列的酶促反應(yīng)，大大提高了植株中花青素的表達量（圖8）。

3 討論

花青素因其良好的醫(yī)療保健功效而受到越來越多人的青睞，但是目前食品工業(yè)所用的色素多為工業(yè)合成，具有不同程度的毒性，長期食用反而有害健康，因此研究開發(fā)和利用天然色素已經(jīng)成為一種趨勢。AtPAP2基因在煙草中的過量表達能夠顯著提高從4-香豆酰CoA到花青素生物合成過程中相關(guān)基因的表達，可以大大提高花青素的含量且不影響植株的正常生長。由于煙草易于種植且生物量大，轉(zhuǎn)AtPAP2基因的紫色煙草不失為一種提取天然色素的好材料。

近年來，越來越多的花青素合成調(diào)節(jié)基因被克隆出來，并被證明能在其他物種中誘導(dǎo)花青素的合成[12]。王霜等[13]通過分析苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選克隆了一個黃酮代謝相關(guān)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子FtMYB23。轉(zhuǎn)基因過表達的擬南芥種皮顏色均呈現(xiàn)出比野生型更深的褐色;楊捷等[14]從東方百合中克隆花青素生物合成轉(zhuǎn)錄因子Lhsor MYB12基因?；虮磉_分析結(jié)果表明該基因在花蕾發(fā)育過程中表達量逐漸增高，并在花蕾盛開時達到最大值;連文力等[15]通過煙草腺毛特意表達啟動子，構(gòu)建AtPAP1表達載體，獲得了腺毛的腺頭呈紅色的煙草;Zou等[16]從玫瑰中克隆獲得了花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子RrMYB6，研究分析表明該基因在雄蕊中表達最高，在花瓣中表達最低;Nakatsuka等[17]在煙草中過表達龍膽根MYB1R轉(zhuǎn)錄因子，減少了煙草花朵中花青素的積累。Huang等[4]將楊梅中與花青素合成相關(guān)的MrMYB1基因分別導(dǎo)入到煙草和擬南芥中，提高了擬南芥各個組織中花青素的含量，也提高了煙草除葉片外其他組織中花青素的含量。該研究通過在煙草中異位表達AtPAP2基因，也同樣獲得了紫色表型的轉(zhuǎn)基因煙草，并且經(jīng)過初步觀察表明，相對于正常的煙草，紫色煙草在生長速度、生長狀況和開花結(jié)實等特性方面均沒有明顯差異。該研究還證實了可以通過在植物中導(dǎo)入外源花青素合成調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)體內(nèi)花青素生物合成相關(guān)基因的表達，從而影響花青素積累，改變植物顏色，為培育新的色彩各異觀賞植物提供了一種新思路。

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