細(xì)胞遷移介導(dǎo)的金納米顆粒外排作用成像研究

謝曉冬 殷敏 李茜 陳楠

摘要闡明納米材料的細(xì)胞外排途徑對(duì)于其在臨床醫(yī)療方面的應(yīng)用轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。然而，對(duì)于納米材料是否會(huì)在細(xì)胞遷移的過(guò)程中被清除，還缺乏直接的證據(jù)和結(jié)論。本研究以金納米顆粒（AuNPs）作為成像探針，利用暗場(chǎng)顯微鏡實(shí)時(shí)地觀察和分析了細(xì)胞遷移過(guò)程中，AuNPs在收縮絲內(nèi)的運(yùn)動(dòng)和外排過(guò)程。結(jié)果表明，部分被細(xì)胞攝取的AuNPs存在于收縮絲內(nèi)，且顆粒的運(yùn)動(dòng)速率隨著其與胞體距離的增大而減小，當(dāng)收縮絲與胞體斷開聯(lián)系后，AuNPs被遺留在胞外。研究結(jié)果表明，外源性的納米材料可以在細(xì)胞遷移過(guò)程中被外排。此研究結(jié)果有助于設(shè)計(jì)更安全高效的納米材料，并應(yīng)用于診斷和治療。

關(guān)鍵詞金納米顆粒; 暗場(chǎng)成像; 細(xì)胞遷移; 外排作用

1引 言

納米材料被廣泛應(yīng)用于人類疾病（如癌癥和糖尿?。┑脑\斷和治療中[1，2]，但是，納米材料進(jìn)入人體后，會(huì)經(jīng)過(guò)肝、腎以及免疫系統(tǒng)等途徑被清除，降低了靶向診療的效率[3，4]。Poon等[5]詳細(xì)研究了納米材料的肝膽清除路徑，指出肝臟細(xì)胞與材料的相互作用是肝臟清除過(guò)程的關(guān)鍵。納米材料可以通過(guò)外泌體介導(dǎo)的胞吐作用被細(xì)胞外排[6，7]。因此，研究人員嘗試通過(guò)表面修飾來(lái)調(diào)控納米材料的細(xì)胞外排過(guò)程，如Oh等[8]在AuNPs表面修飾PEG，減少了巨噬細(xì)胞對(duì)于金納米顆粒 （Gold nanoparticles， AuNPs）的外排; Qian等[9]在材料表面修飾microRNA，延長(zhǎng)了納米載體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的駐留。近期的研究發(fā)現(xiàn)，除了經(jīng)典的分泌外排方式，細(xì)胞還通過(guò)遷移性胞吐（Migracytosis）過(guò)程釋放一些內(nèi)源性物質(zhì)。細(xì)胞遷移時(shí)，會(huì)在其后方形成收縮絲（Retraction fiber）結(jié)構(gòu)，收縮絲上存在一些遷移體（Migrasome），這是一類直徑為0.5～3.0 μm的囊泡結(jié)構(gòu)。遷移體在細(xì)胞遷移離開后會(huì)留在原地，可以被其它細(xì)胞所攝取[10，11]。例如，在斑馬魚原腸胚發(fā)育階段，一些調(diào)控信號(hào)（如趨化因子）會(huì)通過(guò)這種方式釋放和傳遞，并在斑馬魚組織器官的形成中起關(guān)鍵作用[12]。這種遷移性胞吐被認(rèn)為是一種新的細(xì)胞外排機(jī)制。細(xì)胞遷移是一種普遍現(xiàn)象[13]，如癌細(xì)胞擴(kuò)散常給癌癥的治療造成巨大困難[14]。但是，對(duì)于納米顆粒是否會(huì)在細(xì)胞遷移的過(guò)程中被外排，尚無(wú)明確結(jié)論，這阻礙了納米材料在癌癥診療中的進(jìn)一步應(yīng)用。

研究納米材料細(xì)胞外排的常見方法主要包括電感耦合等離子質(zhì)譜（Inductively coupled plasma mass spectrometry， ICPMS）、透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope， TEM）、熒光檢測(cè)、單顆粒示蹤（Single particle tracking， SPT）等。其中，ICPMS在進(jìn)行樣品處理和元素定量分析的過(guò)程中會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[15]; TEM需要對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行固定，無(wú)法獲取納米顆粒外排過(guò)程的動(dòng)態(tài)信息。熒光檢測(cè)適用于某些熒光納米材料（如量子點(diǎn)Quantum dots， QDs），其它材料卻需要額外的熒光標(biāo)記，這一過(guò)程可能對(duì)納米材料的性質(zhì)產(chǎn)生影響，并改變其與細(xì)胞的相互作用[16]; 而且，一些熒光染料容易發(fā)生光漂白（Photo bleaching），不適合進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間觀察。此外，納米材料的尺寸可以影響其外排能力，然而，基于熒光探針的成像和示蹤手段很難有效區(qū)分大小不一的納米顆粒聚集體。針對(duì)上述研究方法的局限性，以納米貴金屬為探針的暗場(chǎng)成像技術(shù)提供了一種替代性方法[17～19]。基于局域表面等離子體效應(yīng)（Localized surface plasmon resonance， LSPR）[20]，40 nm的AuNPs單顆粒呈現(xiàn)明亮的綠色信號(hào)，聚集后因?yàn)樯⑸涔庾V的紅移而變?yōu)辄S色[21]，可以有效區(qū)分單顆粒和聚集體。AuNPs的散射光信號(hào)不易發(fā)生光漂白，適于長(zhǎng)時(shí)程觀察，已被應(yīng)用于活細(xì)胞成像研究[22，23]。

本研究采用AuNPs作為暗場(chǎng)成像探針，借助單顆粒示蹤方法研究了細(xì)胞遷移過(guò)程中AuNPs的外排情況。結(jié)果表明，細(xì)胞在遷移過(guò)程中形成了收縮絲和遷移體結(jié)構(gòu)，AuNPs以單顆?；蚓奂w的形式存在于收縮絲中，并隨著胞質(zhì)一起朝胞體方向運(yùn)動(dòng)。AuNPs的運(yùn)動(dòng)與其距胞體的距離相關(guān)，距離越遠(yuǎn)，AuNPs的運(yùn)動(dòng)速率越低，并在細(xì)胞遷移離開后被排出胞外。本研究證明了納米顆?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞遷移介導(dǎo)的方式被排出胞外，此研究結(jié)果對(duì)于設(shè)計(jì)安全高效的納米載體具有指導(dǎo)意義。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

緊口細(xì)胞組織研磨器（美國(guó)Kimble公司）; 制備囊泡的支撐膜和多孔聚碳酸酯膜（孔徑400 nm，美國(guó)Avanti公司）; Nano ZS90粒度儀（英國(guó)Malvern公司）; Tecnai G2 Sphera場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（200 kV， 美國(guó)FEI公司）; TCS SP8激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Lecia公司）; IX71倒置暗場(chǎng)顯微鏡（日本Olympus公司）; PIXIS 256光譜儀（ Princeton公司）。

膠體金溶液（40 nm， BBI solutions）、MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素（Penicillin）、胰酶（Trypsin）、鏈霉素（Streptomycin）和左旋谷氨酰胺（Lglutamine），均購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司; HeLa 細(xì)胞（上海生命科學(xué)研究院）; mEmeraldCD81質(zhì)粒（#55013， Addgene公司）; Lipofectamine 3000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒（Thermo Fisher公司）; 35 mm玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿（Cellvis公司）。60 mm和150 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（Corning公司）; 蛋白酶抑制劑（A32955， Thermo Fisher公司）; 實(shí)驗(yàn)所用水為Milli Q超純水（Millipore公司）。巰基修飾和熒光標(biāo)記的寡核苷酸（Takara公司），核酸序列分別為（S1： 5'SHAAAAAAAAAAGAGCTGCACGCTGCCGTC3'， S2CY3： 5'CY3GACGG CAGCGTGCAGCTC3'）; 0.1 mol/L的PBS緩沖液（pH 7.4， 42 mmol/L KH2PO4， 8 mmol/L Na2HPO4， 136 mmol/L NaCl， 2.6 mmol/L KCl）和0.2 mol/L 的PB緩沖液（pH 7.4， 162 mmol/L Na2HPO4， 38 mmol/L NaH2PO4）; 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa 細(xì)胞在含有10% 胎牛血清、100 units/mL青霉素、100 units/mL 鏈霉素和 2 × 103 mol/L 谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基中， 37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

2.3細(xì)胞膜材料的提取

細(xì)胞膜提取采用低滲裂解和差速離心法[24]。培養(yǎng)HeLa細(xì)胞（數(shù)量大于1 × 108），采用含有2 mmol/L EDTA的PBS（pH 7.4）預(yù)冷溶液使細(xì)胞脫壁，然后以500 × g 轉(zhuǎn)速離心收集細(xì)胞。用含有蛋白酶抑制劑的低滲裂解液（2× 102 mol/L TrisHCl， 10 mmol/L KCl， 2 mmol/L MgCl2， pH 7.5）在冰水浴環(huán)境裂解細(xì)胞10 min，用緊口細(xì)胞組織研磨器研磨細(xì)胞裂解液，使細(xì)胞充分破碎。3200 ×g離心5 min后收集上清液，再次20000 × g離心20 min后收集上清液，以100000 × g超速離心60 min后收集細(xì)胞膜沉淀，最后以含有1? mmol/L EDTA的10 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）溶液重懸。

2.4AuNPs修飾DNA熒光鏈

采用加鹽老化法[22]在AuNPs表面修飾巰基DNA鏈，并與互補(bǔ)的熒光DNA鏈雜交。14.9 nmol/L AuNPs原液與采用超純水新溶解的0.1 mmol/L SHDNA鏈（S1）以1∶1000（n/n）的比例混合，25℃下?lián)u床（350 r/min）孵育8 h。然后，加入0.1 mol/L PB緩沖液（pH 7.4）至終濃度為10 mmol/L，10 min后，分4次加入2 mol/L NaCl溶液，每次間隔30 min，至終濃度為0.1 mol/L。孵育12 h后，再以8000 × g轉(zhuǎn)速離心5 min， 移去上清液，用10 mmol/L PB緩沖液重懸清洗，然后將樣品轉(zhuǎn)移至0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4）中，AuNP濃度為1? nmol/L，取新溶解的0.1 mmol/L DNACY3熒光鏈（S2CY3）與DNAAuNPs樣品混合（3000∶1， n/n），并于37℃避光孵育30 min，以完成熒光鏈的雜交。最后，樣品通過(guò)離心去除上清液中游離的S2CY3鏈，并重懸于PBS緩沖液中，備用。

2.5材料包膜組裝、純化和表征

采用擠出法[24]制備HeLa細(xì)胞膜包裹的AuNPs。將提取的細(xì)胞膜材料冰水浴超聲（40 kHz， 100 W， 5 min），取1 mL膜溶液與0.05 mL 1.5 nmol/L AuNPs或DNAAuNPs溶液混合，采用400 nm孔徑的多聚碳酸酯膜將混合液反復(fù)擠出5～10次，收集液體， 以6000 × g離心8 min，取沉淀，并用PBS溶液重懸，再以相同條件離心兩次，去除游離的膜材料。將得到的AuNP@CMVs溶液超聲（40 kHz， 100 W， 5 min）。采用粒度儀對(duì)純化后的AuNPs@CMV的水合粒徑以及表面Zeta電勢(shì)進(jìn)行測(cè)量。采用透射電鏡觀察AuNP@CMVs材料的結(jié)構(gòu)與形貌。

2.6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

HeLa細(xì)胞接種到35 mm玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿，過(guò)夜培養(yǎng)至80%匯合度時(shí)，按照Lipofectamin 3000試劑盒說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入質(zhì)粒DNA脂質(zhì)體復(fù)合物，包含DNA 500 ng、P3000試劑1 μL、Lipofectamine試劑0.75 μL。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜。

2.7材料孵育細(xì)胞

培養(yǎng)在35 mm玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿的HeLa細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，并用PBS漂洗兩次，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入500 μL包含50 pmol/L AuNPs的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后， 漂洗去除胞外材料。

2.8細(xì)胞成像與光譜采集

對(duì)于熒光成像，將攝入材料的mEmeraldCD81質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞固定后置于共聚焦顯微鏡下觀察。CY3標(biāo)記的AuNPs采用561 nm 氦氖激光器激發(fā)，檢測(cè)通道設(shè)置為570～620 nm，使用紅色偽彩，CD81mEmerald采用488 nm激光激發(fā)，檢測(cè)通道為500～550 nm，采用綠色偽彩，NA=1.4063X 的油鏡成像。對(duì)于暗場(chǎng)成像，將攝入材料的活細(xì)胞樣品置于暗場(chǎng)顯微鏡下觀察。采用60倍油鏡 （數(shù)值孔徑0.65），DP74高速真彩CCD進(jìn)行圖像采集，其中曝光時(shí)間為50 ms，成像尺寸為1920×1200，圖像采用ImageJ軟件進(jìn)行處理和分析。光譜采集的曝光時(shí)間為1 s。

3結(jié)果與討論

3.1AuNP@CMVs的制備與表征

細(xì)胞對(duì)于探針的足量攝取是研究納米材料外排的基礎(chǔ)。納米顆粒的尺寸可以影響其細(xì)胞攝取效率， Chithrani等[25]的研究表明， 40～50 nm的AuNPs具有比其它尺寸AuNPs更高的細(xì)胞攝取效率。細(xì)胞膜包裹是一種常用的、增強(qiáng)同類細(xì)胞攝取的方法，如Zhu等[26]采用HeLa癌細(xì)胞膜包裹磁性納米顆粒，實(shí)現(xiàn)了更好的腫瘤靶向效果。因此，本研究選取40 nm的AuNPs，包裹HeLa細(xì)胞膜，制備得到細(xì)胞膜包裹的AuNPs復(fù)合結(jié)構(gòu)（AuNP@CMVs）。采用透射電鏡對(duì)材料形貌進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)AuNPs@CMVs顆粒具有典型的核殼結(jié)構(gòu)[27]，且表面覆蓋有約6 nm的半透明層（圖1A）。利用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量AuNP@CMVs的水合粒徑，結(jié)果表明，包膜后的AuNPs具有較好的分散度（圖1B），其粒徑比AuNPs增加了約20 nm（圖1C）; 而其表面電勢(shì)下降至Symbolm@@10 mV左右（圖1D）?；诒狙芯拷M前期的工作[22]，利用巰基DNA單鏈（S1鏈）對(duì)AuNP表面進(jìn)行修飾，并與標(biāo)記有CY3熒光的互補(bǔ)DNA鏈（S2鏈）進(jìn)行雜交，實(shí)現(xiàn)了對(duì)AuNP@CMVs探針的熒光標(biāo)記。根據(jù)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的結(jié)果，與采用AuNPs制備的DNAAuNP@CMVs粒徑（87.3 nm）相比，采用DNAAuNPs制備的DNAAuNP@CMVs的水合粒徑 （132.1 nm） 有所增大; DNAAuNP@CMVs表面電勢(shì)為

為了考察細(xì)胞對(duì)于AuNP@CMVs探針的攝取情況，HeLa細(xì)胞與AuNP@CMVs共孵育4 h后，采用暗場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行觀察，成像結(jié)果如圖1E所示，細(xì)胞整體形態(tài)良好，且細(xì)胞內(nèi)存在大量AuNPs，說(shuō)明探針具有良好的生物相容性和被細(xì)胞攝取的性質(zhì)。由于局域表面等離子體效應(yīng)[20]，暗場(chǎng)下單顆粒40 nm AuNPs具有較強(qiáng)的綠色散射光，而其聚集體因等離子體耦合效應(yīng)[20，21]，散射光譜波峰會(huì)發(fā)生紅移。為了區(qū)分AuNPs探針的聚合狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的綠色和亮黃色粒子光斑的光譜被分別采集，如圖1F所示，其散射光譜的波峰分別為541 nm（綠色）和655 nm（黃色），與文獻(xiàn)[22]中報(bào)道的AuNPs單顆粒和聚集體的光譜特征一致，證明這些顏色特征明顯的光斑是AuNP@CMVs探針的光學(xué)信號(hào)。上述對(duì)于探針的形貌、結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)的表征結(jié)果說(shuō)明AuNP@CMVs被成功構(gòu)建，且適用于活細(xì)胞成像分析。

3.2AuNPs在收縮絲中的分布

研究表明，AuNPs進(jìn)入細(xì)胞后，在運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生聚集[22]，該現(xiàn)象有助于提高光熱治療的效果[28]。因此，如果進(jìn)入到癌細(xì)胞內(nèi)的AuNPs在癌細(xì)胞遷移的過(guò)程中被外排，會(huì)對(duì)其治療效果產(chǎn)生負(fù)面影響。雖然目前的研究證明了細(xì)胞在遷移過(guò)程中會(huì)殘留和外排一些內(nèi)源性物質(zhì)[12]，但是，對(duì)于AuNPs等外源性納米顆粒是否會(huì)在細(xì)胞遷移時(shí)被排出胞外，還缺乏相應(yīng)的研究。將HeLa細(xì)胞與AuNP@CMVs進(jìn)行孵育后，利用暗場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，在HeLa細(xì)胞遷移過(guò)程中，在其后方產(chǎn)生了絲狀結(jié)構(gòu)（收縮絲）（圖2A和2B），在收縮絲的末端或分叉處可以觀察到球形的遷移體結(jié)構(gòu)（白色箭頭）。值得注意的是，收縮絲上確實(shí)存在AuNPs信號(hào)，包括綠色的單顆粒AuNPs和橙色的AuNPs聚集體 （圖2C和2D）。此結(jié)果提示AuNPs會(huì)在細(xì)胞遷移的過(guò)程中進(jìn)入到收縮絲結(jié)構(gòu)內(nèi)。然而，AuNPs與遷移體并未表現(xiàn)出明顯的共定位關(guān)系。

采用熒光顯微鏡觀察了熒光標(biāo)記的AuNPs在細(xì)胞遷移過(guò)程中的分布。遷移體結(jié)構(gòu)的形成與四跨膜蛋白超家族（Tetraspanin family）有關(guān)。此類蛋白家族有33個(gè)成員，且在各類細(xì)胞中均有表達(dá)，其中Tetraspanin 4和CD81等蛋白的表達(dá)水平與遷移體的數(shù)量顯著相關(guān)[11]。因此，融合有綠色熒光蛋白的CD81被選擇作為標(biāo)記遷移結(jié)構(gòu)的分子。在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)了CD81mEmerald質(zhì)粒，熒光共聚焦顯微成像的結(jié)果表明，CD81分散于細(xì)胞膜上，清晰地標(biāo)記了細(xì)胞膜和收縮絲等結(jié)構(gòu)（圖2E）。與CY3標(biāo)記的DNAAuNP@CMVs進(jìn)行孵育后，發(fā)現(xiàn)CY3熒光修飾的AuNPs信號(hào)（紅色偽彩）與收縮絲（綠色偽彩）存在良好的共定位關(guān)系（圖2F）。在圖2F中白色箭頭所指部位，測(cè)量了劃線處的AuNPs和收縮絲兩個(gè)通道的熒光強(qiáng)度分布，結(jié)果表明AuNPs確實(shí)存在于收縮絲內(nèi)部（圖2E），進(jìn)一步證明了暗場(chǎng)顯微成像的結(jié)果，即在細(xì)胞遷移的過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的AuNPs會(huì)留存于收縮絲等結(jié)構(gòu)中，增加了其被外排的可能性。

3.3AuNPs在收縮絲中的運(yùn)動(dòng)

靜態(tài)成像的結(jié)果表明，部分AuNPs定位于收縮絲內(nèi)，但尚不明確AuNPs是否會(huì)隨著胞質(zhì)回收又重新回到胞體中，或是通過(guò)細(xì)胞遷移介導(dǎo)的胞吐作用被外排。因此，利用暗場(chǎng)顯微鏡對(duì)AuNPs探針在活細(xì)胞遷移過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了實(shí)時(shí)觀察。如圖3A所示，收縮絲可按照其距離胞體的遠(yuǎn)近分為近、中和遠(yuǎn)3個(gè)區(qū)域（分別用紅色、綠色和藍(lán)色線框標(biāo)注），對(duì)3個(gè)區(qū)域中收縮絲上所有AuNPs在330 s持續(xù)觀察窗口（每幀時(shí)間間隔為1 s）內(nèi)的運(yùn)動(dòng)情況分別進(jìn)行了追蹤。如圖3B中的粒子運(yùn)動(dòng)軌跡圖所示，在胞體近區(qū)（Near），AuNPs沿著收縮絲朝向胞體方向運(yùn)動(dòng); 在收縮絲的中部（Middle）和遠(yuǎn)端（Far）區(qū)域，部分AuNPs的運(yùn)動(dòng)軌跡較短。對(duì)于3個(gè)區(qū)域中的AuNPs的運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，近、中、遠(yuǎn)區(qū)域的AuNPs運(yùn)動(dòng)的平均速度分別為0.15、0.07和0.03 μm/s，隨著其與胞體的距離增加而顯著下降（圖3C）。上述結(jié)果表明，胞質(zhì)在收縮絲中的運(yùn)動(dòng)，與胞體距離呈反比，即離細(xì)胞體越遠(yuǎn)，運(yùn)動(dòng)能力越弱。

3.4細(xì)胞遷移介導(dǎo)的AuNPs外排

對(duì)于遷移性外排的研究表明，隨著細(xì)胞的進(jìn)一步遷移，當(dāng)胞體與收縮絲斷開聯(lián)系后，存在于收縮絲和遷移體中的物質(zhì)被遺留在細(xì)胞外[11]。利用暗場(chǎng)顯微成像對(duì)細(xì)胞遷移后殘留的收縮絲結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，AuNPs被留在了斷開的收縮絲結(jié)構(gòu)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞遷移介導(dǎo)的外排（圖4A和4B）。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體介導(dǎo)的胞吐作用會(huì)隨著納米材料尺寸的增加而減弱，如Chithrani等[29]發(fā)現(xiàn)粒徑為14、50和70 nm的AuNPs在1 h的外排百分比分別為35%、10%和5%。為了驗(yàn)證遷移性外排是否也受到納米顆粒尺寸的調(diào)控，對(duì)于殘留在收縮絲結(jié)構(gòu)中的AuNPs單顆粒和聚集體分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明， 68.4%為聚集體，316%為單顆粒（圖4C）。此比例與本研究組前期工作[22]中報(bào)道的細(xì)胞內(nèi)AuNPs的聚集比例（Cluster/Single≈7∶3）非常接近，說(shuō)明細(xì)胞遷移介導(dǎo)的AuNPs的外排并未表現(xiàn)出尺寸選擇性。這一結(jié)果表明細(xì)胞可通過(guò)這種途徑排出不同尺寸的納米材料。上述結(jié)果提供了外源性納米顆粒在細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)生外排的可視化證據(jù)，并提示了這一外排途徑與經(jīng)典的外泌體外排途徑具有不同的調(diào)控和選擇方式。

4結(jié) 論

與納米顆粒的細(xì)胞攝取機(jī)制相比，外排的途徑和機(jī)制研究較為有限，在一定程度上阻礙了納米生物試劑的應(yīng)用拓展。最近的研究揭示了遷移性外排這一新的外排途徑，并證明了此途徑在細(xì)胞間通訊和胚胎發(fā)育等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，尚無(wú)證據(jù)表明外源性納米顆粒是否存在細(xì)胞遷移介導(dǎo)的外排。本研究采用AuNPs探針，結(jié)合暗場(chǎng)成像和單顆粒示蹤等研究手段，探索了細(xì)胞遷移過(guò)程中外源性納米材料的外排途徑。結(jié)果表明，細(xì)胞遷移過(guò)程中會(huì)形成收縮絲結(jié)構(gòu)，部分AuNPs定位在收縮絲內(nèi)，隨著胞質(zhì)回收向胞體方向運(yùn)動(dòng)，且運(yùn)動(dòng)速率與其到胞體的距離呈反比; 當(dāng)細(xì)胞與收縮絲斷開后，無(wú)法回收的AuNPs被排出細(xì)胞。本研究提供了細(xì)胞遷移介導(dǎo)的納米材料外排過(guò)程的成像證據(jù)，并發(fā)現(xiàn)此途徑與外泌體介導(dǎo)的胞吐作用具有不同的選擇性。本研究結(jié)果對(duì)于設(shè)計(jì)更加高效的納米藥物和腫瘤診療探針具有重要意義。

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