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      高靈敏、寬動態(tài)范圍納米流式檢測裝置的研制及應用

      2020-07-14 02:35:11毛翠萍林垚牛倩薛乘風顏曉梅
      分析化學 2020年7期

      毛翠萍 林垚 牛倩 薛乘風 顏曉梅

      摘要基于納米顆粒固有的多分散性,對其粒徑及分布快速地進行高分辨表征是納米顆粒相關研究和產品開發(fā)所面臨的重大挑戰(zhàn)。與電子顯微鏡、原子力顯微鏡、動態(tài)光散射、納米顆粒追蹤分析等常規(guī)使用的納米顆粒表征技術相比,流式細胞術具有可單顆粒檢測、快速、多參數(shù)、統(tǒng)計精確性高等優(yōu)勢。然而,由于檢測靈敏度的局限性,商品化流式細胞儀難以檢測粒徑小于200 nm的聚苯乙烯納米顆粒。結合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術,本研究組研制了納米流式檢測裝置 (Nanoflow cytometer, nFCM),采用單光子計數(shù)雪崩光電二極管 (Single photon counting avalanche photodiode, APD) 作為檢測器,低折射率二氧化硅納米顆粒 (SiO2 NPs) 的檢測下限可達到24 nm,可基線分辨47、59、74、94和123 nm的SiO2 NPs混合樣本。由于nFCM散射光檢測動態(tài)范圍受限于單光子探測器的最大光子計數(shù)值,而納米顆粒的散射光強度隨粒徑的增大呈指數(shù)上升,為實現(xiàn)納米顆粒更全面的粒徑分布檢測,儀器的檢測動態(tài)范圍有待提升。本研究采用激光光束整形、雙光闌降低背景信號、高量子效率光電倍增管檢測器等策略對儀器進行多方位改進,以研制高靈敏、寬動態(tài)范圍的nFCM。改進后的nFCM可實現(xiàn)直徑59 nm SiO2 NPs的高信噪比檢測 (S/N = 119),可基線分辨59、74、94、123、160、180和222 nm的SiO2 NPs混合樣本,相比以APD為檢測器的nFCM,粒徑檢測范圍擴展約100 nm, 并成功用于鼠傷寒沙門氏菌外膜囊泡 (Outer membrane vesicles, OMVs) 粒徑分布的快速測定。

      關鍵詞單顆粒檢測; 光散射; 粒徑分布; 納米流式檢測技術; 細菌外膜囊泡

      1引 言

      了解天然生物納米顆粒(如病毒、細菌、亞細胞器、細胞外囊泡等)以及人工合成納米顆粒(如納米金、納米銀、二氧化硅納米顆粒、納米藥物等)的粒徑大小及其分布,在生物醫(yī)學、生化分析、能源材料、環(huán)境監(jiān)測等領域的研究中具有重要意義[1~9]。雖然透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡等顯微技術能夠直觀、清晰地揭示納米顆粒的粒徑和形貌[10],但是存在樣品制備繁瑣、測量速度慢、粒徑分布缺乏統(tǒng)計代表性等缺點。基于光子相關光譜分析的動態(tài)光散射技術 (Dynamic light scattering, DLS) 能夠快速、準確地測定分散于液體中單分散顆粒,但是對于粒徑分布范圍較寬的顆粒系,測量結果和可靠性較差?;趩晤w粒散射示蹤的納米顆粒追蹤分析技術 (Nanoparticle tracking analysis, NTA) 采用激光照射納米顆粒懸浮液,通過高速相機對視野中的顆粒進行拍照,從而對每個顆粒的布朗運動軌跡進行追蹤和分析,計算各自的流體力學半徑; 然而,顆粒粒徑分布相比于真實分布存在展寬,其準確性和分辨率有待提升[11]。相較于上述技術,流式細胞術 (Flow cytometry, FCM) 是一種對細胞或同等大小的顆粒進行快速的單顆粒多參數(shù)檢測的技術,具有統(tǒng)計精確性高、數(shù)據(jù)可靠等優(yōu)點[12]。然而,商品化流式細胞儀的散射檢測下限是200~500 nm聚苯乙烯顆粒,難以滿足各種功能化納米顆粒以及病毒、細胞外囊泡等納米顆粒的粒徑表征需求[11]。

      根據(jù)瑞利散射定律,當球形納米顆粒的粒徑小于波長的1/5時,其散射光強度隨粒徑的六次方衰減,當納米粒子的粒徑從200 nm減小到40 nm或25 nm,其大小雖然只下降5倍或8倍,但是散射光強度卻降低15625倍或262144倍。結合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術,本研究組成功研制出納米流式檢測裝置 (Nanoflow cytometer, nFCM),將二氧化硅納米顆粒 (SiO2 NPs)、納米金顆粒 (AuNPs) 的散射檢測下限分別降低至24 nm和7 nm,較傳統(tǒng)流式細胞儀的散射檢測靈敏度提升4~5個數(shù)量級[13]。該裝置成功用于SiO2 NPs、納米金、細菌、線粒體、病毒、納米藥物、細胞外囊泡等納米顆粒粒徑及分布的高分辨表征[14~19]。nFCM通常使用光電倍增管 (Photomultiplier tubes, PMT) 或單光子計數(shù)雪崩光電二極管 (Single photon counting avalanche photodiode, APD) 作為檢測器。APD雖然靈敏度高,但是其最大光子計數(shù)值受限于APD的輸出脈沖寬度和死時間,在很大程度上限制了nFCM的動態(tài)檢測范圍,難以對粒徑分布較寬的樣本(如粒徑分布30~1000 nm的細胞外囊泡)進行全面的粒徑表征。相比之下,PMT雖然具有較寬的動態(tài)范圍,但是量子效率較低,難以檢測粒徑小、低折射率的納米顆粒[20]。

      針對細胞外囊泡、納米藥物等粒徑小、粒徑分布較寬的納米顆粒樣本的檢測,本研究研制了高靈敏、寬動態(tài)范圍的納米流式檢測裝置,主要策略包括:(1)將圓形激光光斑整形為準平頂光斑,以保證顆粒在通過激光探測區(qū)時受到強度更均一的照射; (2)聯(lián)合使用孔徑光闌與矩形光闌,最大程度抑制背景信號; (3)采用高量子效率PMT,在寬動態(tài)檢測范圍條件下實現(xiàn)弱散射光信號的檢測。此裝置成功地應用于折射率小、異質性大的細菌外膜囊泡 (Outer membrane vesicles, OMVs) 的粒徑分布測定。

      2實驗部分

      2.1儀器與試劑

      nFCM的光路如圖1A所示,488 nm 激光器(20 mW,美國Coherent公司)發(fā)出的高斯光束經過反光鏡M反射后被二元光學元件 (Binary optical element, BOE)[21]整形,再經消色差膠合透鏡L聚焦成為10 μm × 5 μm的準平頂光斑。單個納米粒子穿越激光探測區(qū)所發(fā)出的光信號被顯微鏡物鏡O(日本尼康公司,40×)收集后,由FF500Di01二向色分光鏡DicF(美國Semrock公司)分為兩束光路(根據(jù)實驗需求,可旋轉DicF,使光束進入相應檢測器),波長<500 nm的光被反射至PMT R928或者H7422PA40(日本濱松公司)進行散射檢測,而波長>500 nm的光經過FF01520/35帶通濾波片BP(美國Semrock公司)后,被第二個PMT R928接收,進行熒光檢測。各檢測器輸出的電信號經過數(shù)據(jù)采集卡(美國National Instruments公司)進行A/D轉換,信號采集和數(shù)據(jù)處理軟件均由LabVIEW語言編程。

      FEITecnai F20透射電子顯微鏡(德國TVIPS公司);BC106NVIS/M光束質量分析儀(美國Thorlabs公司);5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司);OptimaTM XE90超速離心機(美國Beckman Coulter公司)。

      磷酸鹽緩沖液 (Phosphate buffer saline, PBS, pH 7.4)、LB肉湯培養(yǎng)基 (LB broth power)、LB肉湯瓊脂 (LB agar power),均購自上海生工生物工程有限公司,實驗用水為超純水。

      2.2實驗方法

      2.2.1激光光束整形應用于激光光束整形的二元光學元件 (BOE) 是一種具有臺階狀表面浮雕結構的衍射光學器件,通過對入射光進行相位調制,從而在輸出焦面上形成期望的光斑形貌,實驗中所用BOE由清華大學尤政教授課題組饋贈[21]。實驗操作: 將BOE固定于三維平移臺上,并置于激光出射端,使用激光光束質量分析儀對整形后的激光光斑進行實時反饋,通過微調平移臺獲得期望的光斑形狀。以PMT R928為檢測器。

      2.2.2雙光闌降低背景信號使用的光闌分別為可調孔徑光闌 (美國Thorlabs公司),最小孔徑為800 μm; 可調矩形光闌(北京大恒光電公司),安裝于檢測器前端,最小邊長為100 μm。采用整形后的激光光束為激發(fā)光源,PMT R928為檢測器,且PMT增益電壓與2.2.1節(jié)無對應關系。

      2.2.3高量子效率PMT模塊提升靈敏度和動態(tài)范圍檢測器為H7422PA40型PMT,光電陰極材料為GaAsP,在峰值波長的最高量子效率 (Quantum efficiency, QE) 為40%。此模塊由電流輸出型光電倍增模塊及跨阻器構成。為了對比新型PMT H7422PA40與傳統(tǒng)PMT R928(匹配高壓管座C1365401)的性能,這兩款PMT被對稱放置于光路的兩側,通過對二向色分光鏡順時針/逆時針旋轉相同角度, 將光信號反射至相應檢測器,以相同的光程對同一樣本進行檢測。在此實驗中,以相同電流倍增率為標準分別設置兩款PMT的控制電壓,通過對比信噪比評估兩款PMT的靈敏度。采用整形后的激光光束為激發(fā)光源,兩款PMT均使用雙光闌降低背景信號。

      2.2.4樣本準備所使用的SiO2 NPs均由本研究組合成,檢測前用超純水稀釋,待用; 細菌OMVs來自于鼠傷寒沙門氏菌 (CMCC50115),由本實驗室分離純化獲得。

      3結果與討論

      3.1激光光束整形

      納米流式檢測裝置使用的激光器的發(fā)射光束為光強呈高斯分布的圓形光斑,當樣本顆粒經過流體動力學聚焦后, 穿越激光探測區(qū)時,如若偏離樣品流中心線, 將會導致所受激光照射強度的差異,使得樣品信號展寬,從而增大樣品檢測的變異系數(shù) (Coefficient of variation, CV),導致儀器分辨率降低[22]。因此,為了提高儀器分辨率,使用BOE將直徑為0.7 mm的圓形激光光束(圖2A)整形為準平頂光束(圖2B),并通過消色差雙膠合透鏡聚焦為10 μm × 5 μm光斑。以直徑222 nm的SiO2 NPs為試樣,考察激光整形前后nFCM的分辨率變化。透射電鏡的實驗結果表明,SiO2 NPs粒徑非常均一((222 ± 3) nm, n=200), CV僅為1.4%(圖2C)。圖2D1為整形前SiO2 NPs的散射光 (Side scattering, SS) 信號時序圖,每個峰代表單個納米顆粒穿越激光探測區(qū)所發(fā)出的散射光信號,1 min內對上萬個顆粒進行檢測,散射信號強度為 (5718 ± 52) mV,散射信號峰面積的CV為8.2%(圖2D2); 激光光束整形后,光強分布更加均一,SiO2 NPs散射信號強度略增((5920 ± 27) mV,圖2E1),散射光信號峰面積統(tǒng)計直方圖更加符合對稱的正態(tài)分布且峰形變窄,CV下降至6.3%(圖2E2)。實驗結果表明,將圓形高斯光斑整形為準平頂光斑,可提升儀器的分辨率。

      3.2雙光闌降低背景信號

      流式細胞儀的靈敏度主要取決于背景噪聲和信號檢測效率[23]。其中,散射通道的背景噪聲主要來自于激光探測區(qū)的界面(如光窗)散射以及鞘液雜質顆粒的瑞利散射[12]。由于背景信號與探測區(qū)體積呈正比,研制納米流式檢測裝置的主要策略是減小探測區(qū)體積,同時使用可調節(jié)式孔徑光闌以限制石英池光窗散射信號進入檢測器,從而提升檢測信噪比。然而,在使用可調節(jié)式孔徑光闌過程中,樣品信號和背景信號隨著光闌孔徑的減小而同時下降,在保持納米顆粒信號不變的情況下,最大程度降低背景信號是提升儀器靈敏度的關鍵。為了進一步減少激光探測區(qū)鞘液及樣品流的瑞利散射背景,聯(lián)合使用孔徑光闌 (φ 0.8~12 mm) 和矩形光闌 (0.1 mm × 0.1 mm~12 mm × 12 mm)。由流通池照片(圖3A)可見到石英池光窗側壁(C1和C2)及樣品流中心顆粒的散射信號。圖3B為簡化俯視光路圖,A為納米顆粒的有效信號點,B1AB2為樣品流及部分鞘液區(qū)域,B1C1及B2C2為鞘液區(qū)域。激光探測區(qū)的光信號被40×顯微鏡物鏡收集、經二向色濾光片(圖中略去)和組合光闌后到達檢測器。首先,使用孔徑光闌限制來自于石英池兩側(C1和C2)及部分鞘液區(qū)域 (B1C1, B2C2) 的光線進入檢測器,通過微調矩形光闌,僅使得樣品液及部分鞘流發(fā)出的光線能進入檢測器,當試樣顆粒信號基本不變而背景信號最低時,確認為最佳光闌調節(jié)狀態(tài)。以222 nm SiO2 NPs為試樣,當僅使用孔徑光闌時,背景信號強度≈180,樣品檢測信噪比為366(圖3C); 同時使用孔徑光闌和矩形光闌時,背景信號強度降低至約30,樣品檢測信噪比提升至423(圖3D)。實驗結果表明,孔徑光闌及矩形光闌的聯(lián)合使用可有效降低背景信號,提高nFCM檢測裝置的靈敏度。

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