高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響因素分析

唐 鑫，顧舒婕，常璐璐，趙建新，張 灝，陳海琴，陳 衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

高山被孢霉是一種具有很強(qiáng)脂質(zhì)合成能力的產(chǎn)油絲狀真菌，其脂質(zhì)積累量可達(dá)到自身干重的50%以上，其中花生四烯酸(ARA)含量可超過總脂肪酸含量的40%，目前已應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。為提高高山被孢霉的應(yīng)用價值，研究人員常通過優(yōu)化發(fā)酵條件、誘變育種等來提高菌株的生產(chǎn)特性[1-2]。現(xiàn)階段，隨著基因工程的興起，利用分子生物學(xué)手段針對性地改造脂質(zhì)合成相關(guān)基因、構(gòu)建重組菌能夠更有效地實現(xiàn)總脂質(zhì)以及特定脂肪酸產(chǎn)量的提高[3]。與酵母和細(xì)菌不同，絲狀真菌本身生長狀態(tài)差異較大，發(fā)酵過程較不穩(wěn)定。絲狀真菌對不同的培養(yǎng)條件如碳源、氮源、發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量等十分敏感，可對菌體的生長和代謝造成較大的影響。為進(jìn)一步探究高山被孢霉的發(fā)酵特點，本研究從初始葡萄糖質(zhì)量濃度、活化次數(shù)、接種量、裝液量、發(fā)酵時間、菌球打碎時間等方面分析發(fā)酵培養(yǎng)條件對高山被孢霉生長和脂質(zhì)積累的影響，并確定最適培養(yǎng)條件，為高山被孢霉的研究以及遺傳改造過程中轉(zhuǎn)化子篩選的準(zhǔn)確性提供更為穩(wěn)定的數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

本實驗所用菌株為高山被孢霉ATCC 32222，購自美國菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑

正十五烷酸(C15∶0)、鹽酸-甲醇，Sigma；F006葡萄糖試劑盒，南京建成；酵母提取物、氯化鈉、甲醇、氯仿、鹽酸、正己烷、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、七水合硫酸鎂，國藥集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基

Broth種子培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母提取物，1 g/L KH2PO4，0.25 g/L MgSO4·7H2O，10 g/L KNO3。

Broth發(fā)酵培養(yǎng)基：50 g/L葡萄糖，5 g/L酵母提取物，1 g/L KH2PO4，0.25 g/L MgSO4·7H2O，10 g/L KNO3。

1.1.4 主要儀器

T10 basic Ultra-turrax高速分散機(jī)，德國IKA；G-GP2010 Plus氣相色譜儀，日本島津；ND100-2氮氣吹掃儀，杭州瑞誠；a5100微型單反數(shù)碼相機(jī)，日本索尼。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

200 μL孢子液(107個/mL)接種于Broth種子培養(yǎng)基，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，棄上清，使用高速分散機(jī)，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速打散菌體20 s，按1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量接種于新的種子培養(yǎng)基，重復(fù)2次至菌體生長為狀態(tài)良好、大小均一的松散毛球狀。使用高速分散機(jī)以8 000 r/min轉(zhuǎn)速打散菌體20 s，按1%接種量接入Broth發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、200 r/min培養(yǎng)7 d?；罨^程的培養(yǎng)體系為250 mL搖瓶，裝液量40%(體積分?jǐn)?shù)，下同)。

在考察不同培養(yǎng)條件對菌株生長和產(chǎn)脂的影響時，除所考察的條件有所變化外，其他操作條件均固定。

1.2.2 高山被孢霉生物量及脂肪酸組成和含量測定

發(fā)酵后的菌體樣品經(jīng)200目網(wǎng)篩過濾，用去離子水反復(fù)沖洗菌體，在濾紙上擠干水分，置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干至恒重，使用分析天平稱量，得到菌體干重(DCW)。

將干燥菌體充分研磨至均勻的粉末狀，稱取(50±5)mg干菌粉于提脂瓶中，加入2 mL 4 mol/L的鹽酸溶液，使用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確加入100 μL質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 的溶解于正己烷的正十五烷酸(C15∶0)作為內(nèi)標(biāo)，混勻后于80℃/-80℃反復(fù)凍融3次用于破壁。用甲醇-氯仿法萃取菌內(nèi)脂質(zhì)，充分振蕩，離心后吸取氯仿層于新提脂瓶，重復(fù)2次，新提脂瓶內(nèi)的脂肪酸萃取樣品氮吹至干，用10%鹽酸-甲醇溶液于60℃水浴3 h進(jìn)行甲酯化處理。之后加入1 mL飽和氯化鈉溶液和1 mL正己烷，充分振蕩，萃取得到脂肪酸甲酯。使用GC-MS檢測樣品，分析脂肪酸組成及相對含量。根據(jù)色譜峰的保留時間定性，色譜峰的峰面積與已知濃度和添加量的內(nèi)標(biāo)(C15∶0)進(jìn)行定量，面積歸一化法確定不同脂肪酸相對含量。相關(guān)參數(shù)的計算公式如下。

生物量=菌體干重/培養(yǎng)基體積

脂肪酸含量=脂肪酸質(zhì)量/干菌粉質(zhì)量×100%

去脂生物量=(1-脂肪酸含量)×生物量

脂肪酸絕對量=脂肪酸含量×生物量

1.2.3 培養(yǎng)基上清液殘?zhí)呛繙y定

培養(yǎng)基上清液殘?zhí)呛繀⒖糉006葡萄糖試劑盒進(jìn)行。

1.2.4 菌體形態(tài)觀察與記錄

將培養(yǎng)體系充分搖勻，取3 mL倒入直徑為6 cm的玻璃培養(yǎng)皿并加入等量生理鹽水稀釋，靜置后保持固定距離拍攝菌體形態(tài)照片(微距模式)，觀察和記錄不同培養(yǎng)條件對菌體形態(tài)的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響

微生物發(fā)酵過程中的碳源是菌體形成細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁等各類細(xì)胞組分的重要原料，能夠構(gòu)成細(xì)胞生長所必需的碳骨架[4]。多數(shù)微生物偏好葡萄糖為優(yōu)先碳源[1]，葡萄糖參與的糖酵解過程是為生物體生命活動提供能量的最主要方式。不同碳氮比會影響菌絲體的生長狀態(tài)以及脂質(zhì)積累[5]，高山被孢霉在較高碳氮比下能大量積累脂質(zhì)，而過高的碳氮比不僅會因高滲透壓抑制菌體生長，還會導(dǎo)致碳源浪費(fèi)[4]。因此，確定最適合高山被孢霉產(chǎn)脂和生長的碳氮比具有重要的意義。本研究設(shè)置了20、30、35、40、50、65、80 g/L共計7組初始葡萄糖質(zhì)量濃度，研究高山被孢霉的生長和產(chǎn)脂情況，結(jié)果見圖1。

圖1 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下高山被孢霉生長、產(chǎn)脂情況

由圖1可知，當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度低于50 g/L時，高山被孢霉的生物量隨著培養(yǎng)基中葡萄糖含量的增加而提高，表明葡萄糖為菌絲體細(xì)胞的生長提供了可利用的碳源，而初始葡萄糖質(zhì)量濃度處于低水平時(<30 g/L)，無法滿足高山被孢霉產(chǎn)脂所需的高碳氮比，其生物量較低。當(dāng)培養(yǎng)基中的初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L時，菌體的生長情況最好，生物量達(dá)到9.4 g/L，脂肪酸絕對量高達(dá)3.0 g/L。而葡萄糖質(zhì)量濃度高于50 g/L時，菌體生物量和脂質(zhì)積累量有所降低。這可能是由于高濃度糖使細(xì)胞處于高滲透壓的環(huán)境脅迫狀態(tài)導(dǎo)致代謝水平失衡[6]，同時可能產(chǎn)生一些有害副產(chǎn)物使菌體生理活動受影響[7]，阻礙菌絲體的正常生長。

進(jìn)一步對不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下高山被孢霉中脂肪酸組成及相對含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下脂肪酸組成及相對含量

注：表中僅列出相對含量>3%的脂肪酸。下同。

由表1可知，隨著初始葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，高山被孢霉中ARA含量大幅度降低，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L時ARA含量高達(dá)57.26%，當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度高達(dá)80 g/L時ARA含量下降至42.62%，與此同時，以C16∶0、C18∶0和C18∶1為代表的飽和及單不飽和脂肪酸含量顯著增加，表明高初始葡萄糖質(zhì)量濃度下脂肪酸的脫飽和及延長途徑受阻[6]。有研究顯示，碳源等營養(yǎng)原料不足時菌體進(jìn)入老化階段，在此時期內(nèi)菌體生物量積累停止而ARA產(chǎn)量大幅度提高[8]。綜合比較菌體的生長和產(chǎn)脂情況，選擇初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L。

2.2 活化次數(shù)對高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響

菌體需達(dá)到相對一致的生長狀態(tài)時才能接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，以保證培養(yǎng)過程中菌體生長發(fā)酵的穩(wěn)定性，減少菌體個體生長差異對實驗結(jié)果的影響。高山被孢霉要經(jīng)過多次活化才能達(dá)到最佳生長狀態(tài)，通常一次活化需2～3 d，重復(fù)活化2～3次，直至長成個體均一、形態(tài)飽滿的白色絨毛狀菌球再接入發(fā)酵培養(yǎng)基。設(shè)置活化1、2、3、4、5次5組條件，每組3個平行。比較不同活化次數(shù)對高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，活化次數(shù)對菌體生物量影響不大，但脂肪酸的合成受到影響，導(dǎo)致各活化次數(shù)下去脂生物量和脂肪酸絕對量有所不同?；罨?次和2次的菌體脂肪酸含量均小于40%，第3次活化后脂肪酸含量達(dá)到最高。之后隨著活化次數(shù)增加，脂質(zhì)積累性能總體降低，可能是活化次數(shù)過多而導(dǎo)致菌體活性降低、增殖能力減弱、遺傳性狀丟失或生物學(xué)功能衰退。

不同活化次數(shù)下高山被孢霉脂肪酸組成及相對含量見表2。

由表2可知，活化次數(shù)對高山被孢霉脂肪酸組成的影響較小，因此為避免多次活化帶來的不利影響，本實驗選擇將產(chǎn)脂性能最好、活化3次的菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.3 接種量對高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響

菌株的接種量與生長狀態(tài)密切相關(guān)。液體培養(yǎng)基中高山被孢霉菌球的密度決定著菌株達(dá)到穩(wěn)定期的時間，直接關(guān)系到培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧的傳遞效率及菌絲體的生長發(fā)酵情況。有研究表明高接種密度下菌體延滯期縮短，可較快到達(dá)對數(shù)生長期從而縮短整個發(fā)酵周期[9]。將活化3次的菌體以0.5%、1%、2%、3%、4%的5個梯度接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每組設(shè)置3個平行。不同接種量下高山被孢霉菌體形態(tài)見圖3，不同接種量下高山被孢霉生長、產(chǎn)脂情況見圖4。

圖3 不同接種量下高山被孢霉菌體形態(tài)

圖4 不同接種量下高山被孢霉生長、產(chǎn)脂情況

由圖3和圖4可知，接種量為1%～2%時高山被孢霉呈毛球狀，菌球大小一致，分布均勻，生長狀態(tài)最佳。當(dāng)接種量為0.5%時，菌球個體大、數(shù)量少，生長不均勻，生物量僅為9.13 g/L，該條件下脂肪酸產(chǎn)量顯著低于其他組別，可能因為0.5%接種量所形成的大體積菌球內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸、尤其是溶解氧的傳遞受阻嚴(yán)重[10]。當(dāng)接種量超過1%時，接入培養(yǎng)基的菌絲在生長過程中縮聚成一個個表面相對光滑的緊實小菌球。研究表明，絲狀真菌在適合自身生長的條件下不易結(jié)成緊密的球體，而在營養(yǎng)匱乏時菌絲聚集現(xiàn)象加倍出現(xiàn)[11]。

對不同接種量下脂肪酸組成及相對含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，接種量對各類脂肪酸相對含量無明顯影響?？紤]到菌體生長速度、生物量和脂質(zhì)積累量，選擇2%～3%為最適接種量。

表3 不同接種量下脂肪酸組成及相對含量

2.4 裝液量對高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響

溶解氧含量是影響菌體生長和產(chǎn)脂的關(guān)鍵因素之一，而裝液量與搖瓶培養(yǎng)體系中溶解氧含量密切相關(guān)[10]，裝液量越小，培養(yǎng)基與空氣的接觸面積越大，溶氧量越多。將Broth發(fā)酵培養(yǎng)基分別按照20%、30%、40%、50%、60%裝液量分裝，探究裝液量對高山被孢霉生長發(fā)酵的影響。不同裝液量下高山被孢霉菌體形態(tài)見圖5，生長、產(chǎn)脂情況見圖6。

圖5 不同裝液量下高山被孢霉菌體形態(tài)

圖6 不同裝液量下高山被孢霉生長、產(chǎn)脂情況

由圖5可知，在20%裝液量下，菌球體積小且表面光滑，這是菌體對所處培養(yǎng)環(huán)境的響應(yīng)表現(xiàn)。有研究表明，在高溶氧量條件下，菌體因受到高氧濃度的脅迫，菌絲生長被束縛并開始加速分化，菌體表面部分結(jié)構(gòu)裂解，形成光滑的外壁，這是菌體在高氧壓力下的一種自我應(yīng)激保護(hù)機(jī)制[12]。裝液量增加后，菌株逐漸生長成絨毛狀的蓬松小球。菌絲在培養(yǎng)過程中需浸沒在培養(yǎng)基中以保證營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，裝液量可能成為限制菌絲向外延伸、擴(kuò)大的因素，因而菌球體積在20%裝液量時最小并隨裝液量的增加而增大。

由圖6可知，高山被孢霉的去脂生物量幾乎沒有隨著裝液量的改變而變化，但脂肪酸絕對量與裝液量呈負(fù)相關(guān)，裝液量20%時脂肪酸含量達(dá)到45.72%，分別比其他4組提高6.20%、6.60%、10.97%、17.74%，推測溶氧量會改變菌株的代謝途徑，溶解氧缺乏的情況不利于產(chǎn)油微生物將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三酯積累于胞內(nèi)，也不利于不飽和脂肪酸的生成[7，13]。

不同裝液量下脂肪酸組成及相對含量見表4。

由表4可知，隨著裝液量的增加，菌體飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸含量之比(SFAs/PUFAs)無明顯變化，可能因為本研究中氧氣供給量的改變不足以影響脂肪酸的脫飽和作用。有研究表明，溶解氧濃度在一定范圍內(nèi)增加能夠促進(jìn)高山被孢霉中不飽和脂肪酸花生四烯酸(ARA)的合成，但氧含量過高時菌體需利用額外的能量來響應(yīng)高濃度氧對細(xì)胞的氧化脅迫，誘導(dǎo)代謝向所不需要的方向進(jìn)行，ARA的生成受阻礙[13-14]。此外，由于高裝液量、低溶氧量下培養(yǎng)的菌體形態(tài)較大，菌球外緣呈放射狀聚集的菌絲會抑制溶解氧的傳遞，同時在一定程度上阻礙了營養(yǎng)成分和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸通路，這會導(dǎo)致菌球內(nèi)部無法獲得充足的養(yǎng)分且氧傳遞速率很低，一些有毒有害的代謝產(chǎn)物也不能及時排出，對菌株的發(fā)酵生產(chǎn)十分不利[7]。根據(jù)脂質(zhì)合成情況選擇溶氧量最大的20%裝液量作為優(yōu)化條件。

表4 不同裝液量下脂肪酸組成及相對含量

2.5 發(fā)酵時間對高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響

經(jīng)活化的高山被孢霉在接入發(fā)酵培養(yǎng)基之后存在短暫延滯期再進(jìn)入對數(shù)生長期[6]，此時去脂生物量快速增加，大量消耗碳源、氮源，脂質(zhì)合成開始但處于較低水平。之后在氮限制下菌體生長受到抑制，脂質(zhì)積累相關(guān)酶活性改變，為脂肪酸的形成提供了充足的乙酰-CoA碳源底物和NADPH還原力，高山被孢霉生長速度減緩甚至停止轉(zhuǎn)而大量生成脂肪酸，培養(yǎng)基中殘?zhí)亲鳛橹舅岷铣傻闹匾先员徊粩嗬肹15]，葡萄糖消耗量持續(xù)下降，其中5.5～7 d時菌體耗糖速度最快，即這段時間是脂質(zhì)快速積累期(見圖7)。

圖7 不同發(fā)酵時間下高山被孢霉培養(yǎng)基上清液殘?zhí)呛?/p>

不同發(fā)酵時間下高山被孢霉生長、產(chǎn)脂情況見圖8。

圖8 不同發(fā)酵時間下高山被孢霉生長、產(chǎn)脂情況

由圖8可知，高山被孢霉在發(fā)酵7 d前后的去脂生物量幾乎沒有發(fā)生變化，菌絲體生長十分緩慢甚至接近停止。但發(fā)酵7 d時高山被孢霉的脂肪酸含量比5.5 d時提高了14.38%，到8.5 d時脂肪酸含量進(jìn)一步上升并達(dá)到最高,這符合發(fā)酵后期菌體代謝由生長期進(jìn)入脂肪酸積累期的一般規(guī)律[2]。高山被孢霉在培養(yǎng)8.5 d時已基本完成脂質(zhì)的快速積累，但11.5 d時脂肪酸含量比10 d時又降低了7.72%，說明菌體內(nèi)脂肪酸含量在第8.5～10 d時相對穩(wěn)定，因此選取該發(fā)酵時期的菌體進(jìn)行脂肪酸提取。此外，菌體的去脂生物量在10 d和11.5 d的發(fā)酵末期內(nèi)分別提高10.05%和13.62%，推測可能在發(fā)酵后期碳源即將耗盡時菌體啟動細(xì)胞自噬[16]，在一些分解酶的作用下降解部分細(xì)胞器、已合成脂肪酸和非必要蛋白質(zhì)等成分，為生物體的生命代謝提供必要的能量和碳骨架，因而去脂生物量增加[4]。

不同發(fā)酵時間下脂肪酸組成及相對含量見表5。

表5 不同發(fā)酵時間下脂肪酸組成及相對含量

由表5可知，C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3 4種脂肪酸的含量隨發(fā)酵時間的延長而降低，而其特征脂肪酸ARA的含量隨發(fā)酵時間的延長而增加。綜上，選擇8.5 d作為高山被孢霉的發(fā)酵時間。

2.6 菌球打碎時間對高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響

高山被孢霉等絲狀真菌在培養(yǎng)過程中會聚集成小球狀，菌株的活化需要將菌球打散成菌絲并接入新的培養(yǎng)基，之后在振蕩培養(yǎng)過程中重新長成菌球。菌球破碎程度不僅會影響活化過程中菌球的均一性從而影響發(fā)酵結(jié)果的穩(wěn)定，還會因外加的機(jī)械力影響菌體的活性。前期實驗發(fā)現(xiàn)，不同打碎程度對菌絲的生長狀態(tài)有明顯的影響。取活化3代的菌體，將菌球以8 000 r/min轉(zhuǎn)速分別打碎20、40、80、120、160 s至均勻菌絮狀，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，不同菌球打碎時間下高山被孢霉菌體形態(tài)(發(fā)酵1 d)見圖9。不同菌球打碎時間下高山被孢霉生長、產(chǎn)脂情況見圖10。

圖9 不同菌球打碎時間下高山被孢霉菌體形態(tài)(發(fā)酵1 d)

圖10 不同菌球打碎時間下高山被孢霉生長、產(chǎn)脂情況

由圖9～圖10可知，在菌球打碎時間較短時(20、40 s)，菌絲在發(fā)酵1 d后就開始聚集形成小型菌球雛形，而菌球打碎時間較長(80、120、160 s)的菌體仍呈分散的顆粒狀菌絲且菌絲生長稀薄，生長速度延緩。發(fā)酵培養(yǎng)7 d后菌體的形態(tài)基本達(dá)到一致，生物量穩(wěn)定在9.0 g/L，只有打碎程度最高(菌球打碎時間160 s)的菌體生長情況較差，其生物量和去脂生物量分別只有8.40 g/L和5.29 g/L，表明打碎程度會影響菌體活性和生長速度，而打碎時間過長時菌體難以恢復(fù)到較好生長狀態(tài)。可見，打碎程度雖對高山被孢霉的生長終狀態(tài)影響不大，但過高的打碎程度會明顯降低菌體的生長速度，進(jìn)而影響菌絲體的發(fā)酵生長。打碎20～120 s的菌體脂肪酸產(chǎn)量相差不大，僅呈略微下降趨勢，打碎20 s時菌體的脂肪酸含量最高，達(dá)到39.74%。將打碎時間延長至160 s時，菌體脂肪酸含量降低了6.97%。

不同菌球打碎時間下脂肪酸組成及相對含量見表6。

由表6可知，打碎20 s時ARA的含量最高，表明此時高山被孢霉的脂肪酸生產(chǎn)特性表現(xiàn)最佳。綜上，選擇20 s為最佳菌球打碎時間。

表6 不同菌球打碎時間下脂肪酸組成及相對含量

3 結(jié) 論

高山被孢霉作為已經(jīng)應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)花生四烯酸(ARA)的菌株，具有良好的應(yīng)用價值和開發(fā)前景。本研究比較了不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度、活化次數(shù)、接種量、裝液量、發(fā)酵時間、菌球打碎時間等不同發(fā)酵條件下高山被孢霉的生長及產(chǎn)脂情況，完成對其所產(chǎn)脂肪酸的提取和分析，發(fā)現(xiàn)初始葡萄糖質(zhì)量濃度、裝液量和發(fā)酵時間對高山被孢霉生長、產(chǎn)脂的影響最為突出，得到高山被孢霉產(chǎn)脂的最佳發(fā)酵條件：初始葡萄糖質(zhì)量濃度50 g/L，裝液量20%(體積分?jǐn)?shù))，菌株需活化3次，打碎20 s至均勻狀態(tài)，按2%～3%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入Broth發(fā)酵培養(yǎng)基，200 r/min、28℃培養(yǎng)8.5 d。本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然較高的初始葡萄糖質(zhì)量濃度可以促進(jìn)高山被孢霉脂質(zhì)積累，但是發(fā)酵末期葡萄糖剩余量較高，造成碳源浪費(fèi)并提高了發(fā)酵成本，而且高葡萄糖濃度會抑制ARA的積累。由于ARA等長鏈多不飽和脂肪酸的合成主要由脂肪酸脫飽和酶和延長酶參與，后續(xù)可對外源葡萄糖濃度對脂肪酸脫飽和及延長途徑關(guān)鍵酶的活性調(diào)控進(jìn)行探究，在保證菌株生長和產(chǎn)脂的基礎(chǔ)上，通過分批補(bǔ)料等方式控制發(fā)酵過程中葡萄糖濃度、提高脂肪酸脫飽和及延長過程關(guān)鍵酶的活性，為進(jìn)一步促進(jìn)高山被孢霉高產(chǎn)具有高附加值的長鏈多不飽和脂肪酸提供更好的理論基礎(chǔ)。