響應(yīng)面優(yōu)化芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取工藝

高錦鴻，蘆 鑫，賈 聰，王瑞丹， 孫 強，黃紀念,3

(1.河南省農(nóng)科院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心， 鄭州 450002； 3.農(nóng)業(yè)部油料加工重點實驗室，武漢 430062)

目前，國內(nèi)芝麻加工以芝麻油生產(chǎn)為主，75%的芝麻用于制油[1]。制油過程中會產(chǎn)生大量芝麻餅粕，據(jù)測算，我國每年產(chǎn)生50萬t以上芝麻餅粕[2]。受加工水平所限，國內(nèi)芝麻餅粕主要用作飼料與肥料，芝麻餅粕資源未得到充分合理利用。研究表明，芝麻餅粕除含有豐富的蛋白質(zhì)外，還含有一定的芝麻素酚糖苷。芝麻素酚糖苷是一種水溶性芝麻木酚素，主要以芝麻素酚三糖苷形式存在，其分子式為C38H48O22[3-4]。盡管芝麻素酚三糖苷在體外抗氧化活性較弱[5-6]，但其在體內(nèi)腸道菌群及β-葡萄糖苷酶作用下可以轉(zhuǎn)化為具有較強抗氧化活性的芝麻素酚及其他酚類化合物，從而降低機體氧化應(yīng)激水平[7-9]，對健康發(fā)揮有益作用，具有研究與應(yīng)用價值。

目前，從芝麻中提取芝麻素酚三糖苷的方法主要包括磁力攪拌法[10]、超聲波輔助法[11]、回流提取法[12]和亞臨界提取法[13]。磁力攪拌法及回流提取法具有操作簡單，設(shè)備成本低的優(yōu)點，但存在耗時較長，提取率低的問題；亞臨界提取法雖耗時較短，效率高，但其設(shè)備能耗較高，且不易操作；與前3種方法相比，超聲波輔助法對于物質(zhì)提取具有強化作用，且操作簡便，效率高。高錦鴻等[11]以芝麻為原料，乙醇為提取溶劑，研究了乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲提取溫度和超聲提取時間對芝麻中芝麻素酚三糖苷提取率的影響規(guī)律，但未對超聲波輔助提取芝麻素酚三糖苷的其他重要影響因素如超聲功率、超聲波作用方式、pH、轉(zhuǎn)速進行分析。因此，本研究在前期試驗的研究基礎(chǔ)上，以芝麻粕為原料，利用單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的工藝參數(shù)，并考察超聲功率、超聲波作用方式、pH、轉(zhuǎn)速對芝麻粕中芝麻素酚三糖苷得率的影響規(guī)律，以期為芝麻粕的高值化利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

亞臨界芝麻粕：芝麻經(jīng)軋坯后，以液化氣為萃取劑，在亞臨界狀態(tài)下，萃取3次，萃取條件為壓力1.0 MPa、萃取溫度50℃、料液比1∶3、萃取時間2 h，固液分離后得到亞臨界芝麻粕(主要成分：水分(6.86±0.10)%，糖類含量(39.38±0.20)%，蛋白質(zhì)含量(38.21±0.08)%，灰分含量(10.93±0.16)%，脂肪含量(4.62±0.23)%)。

芝麻素酚三糖苷標準品(實驗室自制[11]，液相純度98.13%)，聚酰胺填料(100～200目)，葡聚糖凝膠LH-20，乙醇、硼酸、凱氏定氮催化劑、濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純，甲醇為色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

XH-2008DE智能溫控雙頻超聲波合成/萃取儀，DL-5-B離心機，TGL-16A離心機，XS205電子天平，RE52-86A型旋轉(zhuǎn)蒸儀，Ultimate 3000高效液相色譜儀，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，K-05型全自動凱氏定氮儀，KDN-12C數(shù)顯溫控消化爐，TM-0910P陶瓷纖維馬弗爐，CMR-420純水機。

1.2 試驗方法

1.2.1 芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取

稱取一定量過60目篩的亞臨界芝麻粕樣品，置于25 mL具塞錐形瓶中，按照料(芝麻粕質(zhì)量)液(乙醇溶液體積)比1∶40，加入80%乙醇溶液，放入轉(zhuǎn)子，調(diào)節(jié)溶液pH，稱重，在不同的超聲波作用方式、功率及轉(zhuǎn)速下，(40±1)℃恒溫提取20 min，提取結(jié)束后，冷卻，補足到先前稱重時的質(zhì)量，搖勻后靜置，吸取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后置于進樣瓶中，高效液相色譜法定量。

1.2.2 芝麻素酚三糖苷的HPLC測定條件

Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm); 檢測波長290 nm；柱溫 30℃；進樣量10 μL。以流動相甲醇(A)和水(B)進行梯度洗脫：0 min(1 mL/min，40%A)→10 min(1 mL/min,40%A)→15 min(0.8 mL/min,40%A)→35 min(0.8 mL/min,40%A)→40 min(1 mL/min,80%A)→50 min(1 mL/min,80%A)→55 min(1 mL/min,40%A)[11]。

1.2.3 芝麻素酚三糖苷標準曲線的建立

精確稱取9.20 mg(精確至0.01 mg)芝麻素酚三糖苷標準品，使用甲醇溶解并定容至50 mL,配成質(zhì)量濃度為184 μg/mL的芝麻素酚三糖苷母液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為7.36、 18.40、55.20、92.00、128.80、165.60 μg/mL的標準溶液。將標準溶液進行HPLC分析，以芝麻素酚三糖苷標準溶液的質(zhì)量濃度(X) 作為橫坐標、峰面積(Y) 作為縱坐標繪制標準曲線。標準曲線回歸方程為Y=16.825X-0.493 2，線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 3，線性范圍為7.36～165.60 μg /mL。

1.2.4 芝麻素酚三糖苷得率的計算

芝麻素酚三糖苷得率=VC/W

式中:V為提取液體積，mL;C為提取液中芝麻素酚三糖苷的質(zhì)量濃度，mg/mL;W為亞臨界芝麻粕質(zhì)量，g 。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析， 采用Origin 8.5進行單因素制圖，采用SAS 9.4進行響應(yīng)面分析。單因素試驗圖中相同字母表示各數(shù)值之間沒有顯著性差異。p<0.05 為顯著，p<0.01 為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲波作用方式的影響

在超聲功率1 200 W、提取液 pH 7.0、轉(zhuǎn)速100 r/min、不同超聲波作用方式(連續(xù)或間歇)條件下超聲提取，研究不同超聲波作用方式對芝麻素酚三糖苷得率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知：逐漸延長超聲波工作時間，芝麻素酚三糖苷得率逐漸升高，當超聲波作用方式為連續(xù)時，芝麻素酚三糖苷得率最高；隨著超聲波間歇時間的延長，芝麻素酚三糖苷得率逐漸降低。因此，選擇超聲波作用方式為連續(xù)。

注：作用方式中的數(shù)據(jù)比為工作時間與間歇時間的比，時間單位為s。

圖1 超聲波作用方式對芝麻素酚三糖苷得率的影響

2.1.2 超聲功率的影響

在提取液pH 7.0、轉(zhuǎn)速100 r/min、不同超聲功率條件下連續(xù)超聲提取，研究不同超聲功率對芝麻素酚三糖苷得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖1 超聲功率對芝麻素酚三糖苷得率的影響

由圖2可知，超聲功率為0 W時，芝麻素酚三糖苷得率較低，為2.72 mg/g。在0～1 200 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率增大，芝麻素酚三糖苷得率隨之提高，這是由于超聲功率增大，空化作用和機械作用越強烈，芝麻素酚三糖苷擴散速率增加，從而提升提取液中濃度[14]。超聲功率為1 200 W時，芝麻素酚三糖苷得率為4.04 mg/g，與超聲功率為0 W相比，芝麻素酚三糖苷得率提高了48.5%。超聲功率超過1 200 W后，隨著超聲功率的增加，芝麻素酚三糖苷得率趨于平穩(wěn)。故選擇超聲功率為 1 200 W。

2.1.3 提取液pH的影響

在超聲功率1 200 W、轉(zhuǎn)速100 r/min、不同提取液pH條件下連續(xù)超聲提取，研究不同提取液pH對芝麻素酚三糖苷得率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在酸性條件下，隨著pH的升高，芝麻素酚三糖苷得率整體上逐漸升高，當pH達到7.0時，芝麻素酚三糖苷得率最高，當pH進一步升高，溶液呈堿性時，芝麻素酚三糖苷得率略有下降。這可能是因為酸性條件導(dǎo)致芝麻素酚三糖苷結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，使其結(jié)構(gòu)降解或轉(zhuǎn)化為其他化合物，而堿性條件下對芝麻素酚三糖苷沒有明顯的破壞作用，這一結(jié)果與文獻[15]報道結(jié)果一致，進一步說明芝麻素酚三塘苷在pH 7.0時結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。因此，選擇提取液pH為7.0。

圖3 提取液pH對芝麻素酚三糖苷得率的影響

2.1.4 轉(zhuǎn)速的影響

在超聲功率1 200 W、提取液pH 7.0、不同轉(zhuǎn)速條件下連續(xù)超聲提取，研究不同轉(zhuǎn)速對芝麻素酚三糖苷得率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)速對芝麻素酚三糖苷得率的影響

由圖4可知，隨著轉(zhuǎn)速的提高，芝麻素酚三糖苷得率逐漸升高，在轉(zhuǎn)速達到400 r/min時，芝麻素酚三糖苷得率最高，隨著轉(zhuǎn)速的進一步提升，芝麻素酚三糖苷得率趨于穩(wěn)定，這說明當轉(zhuǎn)速達到400 r/min時，芝麻素酚三糖苷從芝麻粕中溶入溶劑的過程已達到動態(tài)平衡，繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速只會增加能源消耗。因此，選擇轉(zhuǎn)速為400 r/min。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用連續(xù)超聲提取，以超聲功率(X1)、提取液pH(X2)、轉(zhuǎn)速(X3)為考察因素，以芝麻素酚三糖苷得率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型與方差分析

注：*差異顯著(p<0.05)；**差異極顯著(p<0.01)。

2.2.3 驗證試驗

利用SAS 9.4 軟件對芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取條件進行優(yōu)化，得到芝麻素酚三糖苷的最優(yōu)提取條件為超聲功率1 226.29 W、提取液pH 7.73、轉(zhuǎn)速432.19 r/min，此條件下芝麻素酚三糖苷得率的預(yù)測值為4.34 mg/g。由于實際操作的可行性，選取超聲功率1 220 W、提取液pH 7.7、轉(zhuǎn)速430 r/min、超聲波作用方式為連續(xù)，進行芝麻素酚三糖苷提取試驗，重復(fù)3次，平均得率為(4.31±0.03)mg/g，與預(yù)測值接近，表明此模型合理有效。說明回歸方程可以反映各因素對芝麻素酚三糖苷得率的影響。

彭珍等[16]通過回流法對芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取工藝進行研究，最終芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的得率為0.44 mg/g。本研究利用響應(yīng)面優(yōu)化芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取工藝，得率為(4.31±0.03)mg/g，盡管所采用乙醇體積分數(shù)、料液比較高，但溶劑可再回收利用，且具有提取時間短、得率高的優(yōu)勢。因此，超聲波輔助提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的效果較好。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用SAS 9.4軟件，根據(jù)Box-Behnken 的試驗設(shè)計原理，利用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波-磁力攪拌協(xié)同提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的工藝條件。通過回歸數(shù)學(xué)模型得到最優(yōu)工藝條件為: 超聲功率1 220 W，提取液pH 7.7，磁力攪拌轉(zhuǎn)速430 r/min，超聲波作用方式為連續(xù)。在最優(yōu)工藝條件下，芝麻素酚三糖苷得率為(4.31±0.03) mg/g。