髓源抑制性細(xì)胞在卵巢癌患者外周血中的檢測(cè)及臨床意義

武榮榮 薛麗麗 李永祥 過(guò)勇杰

卵巢癌是一種發(fā)病率較高的女性惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣且易反復(fù)發(fā)作是卵巢癌發(fā)病的重要表現(xiàn)之一［1］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌的治療效果不佳可能與腫瘤免疫微環(huán)境有關(guān)［2］。腫瘤免疫微環(huán)境主要由免疫抑制性細(xì)胞及相關(guān)的細(xì)胞因子組成，其與腫瘤細(xì)胞相互作用，共同介導(dǎo)了腫瘤的免疫耐受，從而影響了免疫治療的臨床效果［3-4］。其中“髓樣抑制性細(xì)胞（又稱髓系衍生抑制性細(xì)胞）”（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是近幾年來(lái)備受關(guān)注的免疫抑制細(xì)胞［5］，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，目前主要在腫瘤免疫逃逸中報(bào)道［6］。本資料主要研究卵巢癌患者外周血中MDSCs與卵巢癌疾病的關(guān)系，及其免疫抑制因子ARG1、COX-2以及MDSCs分泌蛋白S100A8和S100A9的表達(dá)水平對(duì)卵巢癌疾病的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 外周血標(biāo)本選自2017年6月至2019年6月在本院收治的卵巢癌患者40例，平均年齡（42.00±3.62）歲；正常對(duì)照組為健康體檢者共30例，平均年齡（45.75±7.49）歲。其中，卵巢癌組單核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)為（0.42±0.068）×109，粒細(xì)胞絕對(duì)數(shù)為（3.91±0.59）×109，淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)為（1.80±0.21）×109；正常組單核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)為（0.41±0.084）×109，粒細(xì)胞絕對(duì)數(shù)為（4.89±0.83）×109，淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)為（1.40±0.21）×109，兩組間比較均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。卵巢癌患者和健康體檢者均簽署知情同意書(shū)。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)嘉興市婦幼保健院倫理委員會(huì)同意。

1.2 方法 （1）流式檢測(cè)外周血MDSCs的百分比：流式細(xì)胞儀為FACS Canto Ⅱ（美國(guó)BD Biosciences公司），檢測(cè)方法采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，抗體包括HLA-DR購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，CD11b和CD33購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。標(biāo)本處理方法：新鮮全血50μl，抗體各10μl，混勻，4℃避光孵育20min；加入溶血素（美國(guó)BD Biosciences公司）2ml，室溫避光10min，溶解紅細(xì)胞；加緩沖液1ml，250×g離心5min洗滌兩次，棄上清液，上機(jī)流式檢測(cè)。用Diva軟件分析。（2）RT-PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中各基因的表達(dá)：抽取卵巢癌患者和健康體檢者靜脈血5ml，用ficoll分離液（北京灝洋生物公司）分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用RNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物公司）提取細(xì)胞總RNA，用NanoDrop測(cè)光密度（OD值）和計(jì)算RNA的濃度。1μg RNA用于cDNA的逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)試劑為TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT kit，熒光定量PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自日本TOYOBO公司，PCR引物由上海Invitrogen分公司合成。引物序列如下：β-actin上 游 引 物GTGGCATCCACGAAACTACCTT，下 游 引 物GGACTCGTCATACTCCTGCTTG；ARG1上游引物TCCCTGTATATCTGCCAAGGATATT，下游引 物 TTCCTAGTCTGTCCACTTCAGTCAT；COX-2上游引物TAAGTGCGATTGTACCCGGAC，下游引物 TTTGTAGCCATAGTCAGCATTGT；S100A8上游引物TGTCTCTTGTCAGCTGTCTTTCA，下游引物CCTGTAGACGGCATGGAAAT；S100A9上 游引 物GGAATTCAAAGAGCTGGTGC， 下 游 引 物TCAGCATGATGAACTCCTCG。反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 ELISA檢測(cè)血清ARG1和S100A9蛋白 ARG1 ELISA試劑盒購(gòu)于北京四正柏公司，S100A9 ELISA試劑盒購(gòu)于武漢Cusabio公司。方法：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品（試劑盒內(nèi)）或待測(cè)血清100μl，混勻，37℃避光孵育2h。棄上清液，加生物素標(biāo)記抗體100μl，孵育1h。棄上清液，洗板3次。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素100μl，孵育1h。棄上清液，洗板5次。加底物（TMB Substrate）90μl，避光顯色30min。最后加入終止液，終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5min內(nèi)用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各個(gè)血清樣本的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDSCs（CD11b+CD33+HLADRLow/-）在外周血中表達(dá)的比例 首先研究MDSCs在卵巢癌患者和體檢者外周血中的表達(dá)情況。圖1A流式設(shè)門描述：先以HLADRLow/-細(xì)胞群為分析對(duì)象，在該細(xì)胞群中選取CD11b+ CD33+的細(xì)胞為觀察對(duì)象，分析其在總細(xì)胞群中所占百分比（見(jiàn)圖1A）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常組和卵巢癌組的外周循環(huán)中均能檢測(cè)到表型CD11b+CD33+HLADRLow/-的MDSCs細(xì)胞群，其百分比是正常體檢組（54.54±2.32）%（n=30），卵巢癌組（69.79±2.38）%（n=40），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）（見(jiàn)圖 1B）。

2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞中ARG1、COX-2、S100A8和S100A9的mRNA表達(dá)水平 通過(guò)提取卵巢癌患者和體檢者外周血單個(gè)核細(xì)胞的RNA，用RT-PCR的方法檢測(cè)ARG1、COX-2、S100A8和S100A9基因的表達(dá)情況，用β-actin作對(duì)照基因，發(fā)現(xiàn)ARG1、COX-2、S100A8和S100A9基因在外周血單個(gè)核細(xì)胞中均有表達(dá)。卵巢癌組外周血單個(gè)核細(xì)胞中ARG1、COX-2、S100A8和S100A9的mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖 2。

圖1 A：卵巢癌組和對(duì)照組的流式分析圖；B：對(duì)照組和卵巢癌組外周血MDSCs表達(dá)比例的對(duì)比?！铩铩铩颬＜0．0001

圖2 ARG1、COX-2、S100A8和S100A9的mRNA表達(dá)量在兩組間的對(duì)比?！颬＜0．05，★★P＜0．01，★★★P＜0．001

2.3 ARG1和S100A9蛋白在血清中的表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法對(duì)卵巢癌患者和體檢者的血清中ARG1和S100A9蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：正常組ARG1的血清濃度為（6.70±0.89）ng/ml（n=30），卵巢癌組ARG1的血清濃度為（37.46±4.28）ng/ml（n=30），與對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）；卵巢癌組S100A9蛋白的血清濃度為（44.74±4.46）ng/ml（n=30），正常組S100A9蛋白的血清濃度為（10.13±1.88）ng/ml（n=30），卵巢癌患者血清中的S100A9表達(dá)明顯高于正常體檢者，兩者有顯著性差異（P＜0.0001），見(jiàn)圖3。

圖3 A：AGR1在對(duì)照組和卵巢癌組中的表達(dá)水平。★★★★P＜0．0001；B：S100A9蛋白在對(duì)照組和卵巢癌組中的表達(dá)水平?！铩铩铩颬＜0．0001

3 討論

卵巢癌的發(fā)病機(jī)制以及疾病發(fā)生發(fā)展尚不明確，發(fā)現(xiàn)時(shí)常為晚期，因此治療效果欠佳。有研究認(rèn)為，卵巢癌患者體內(nèi)存在腫瘤免疫微環(huán)境，通過(guò)多種途徑和機(jī)制發(fā)揮負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答的功能，并分泌相關(guān)細(xì)胞因子間接抑制機(jī)體免疫應(yīng)答［4］。所以，考慮免疫抑制性細(xì)胞可能對(duì)卵巢癌疾病的發(fā)生發(fā)展有重要的促進(jìn)作用。

MDSCs是一群缺乏淋巴系標(biāo)志具有多方向分化潛能和免疫抑制功能的異質(zhì)性細(xì)胞，通過(guò)多種機(jī)制影響髓系細(xì)胞增殖、抑制宿主抗腫瘤免疫、誘導(dǎo)免疫耐受以及促進(jìn)炎癥反應(yīng)［7］。MDSCs有多種免疫抑制作用，一方面可以直接抑制淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞和NK細(xì)胞）的增殖，減少其細(xì)胞因子的分泌；另一方面能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬能力，通過(guò)抑制MHCⅡ表達(dá)，減少M(fèi)HCⅡ和抗原復(fù)合物結(jié)合，降低T細(xì)胞的特異性識(shí)別作用，從而減少T細(xì)胞釋放刺激巨噬細(xì)胞吞噬能力的淋巴因子，這也間接抑制了巨噬細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，卵巢癌患者外周血中MDSCs的表達(dá)量明顯高于健康人群，說(shuō)明MDSCs細(xì)胞在卵巢癌患者的發(fā)病中確實(shí)起到了免疫抑制的作用，而這個(gè)具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。

另外MDSCs 中的一些關(guān)鍵性調(diào)節(jié)酶的表達(dá)升高也能引起免疫抑制反應(yīng)，其中常見(jiàn)的有ARG1和COX-2。ARG1的表達(dá)越高，L-精氨酸的含量就越低，從而產(chǎn)生大量的過(guò)氧化物，導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而COX-2作為重要的免疫抑制因子，是炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的重要參與者。本資料中，在卵巢癌患者和健康人群外周血單個(gè)核細(xì)胞中均檢測(cè)到了ARG1和COX-2的mRNA表達(dá)，其中卵巢癌患者的表達(dá)量明顯高于健康人群，進(jìn)一步證實(shí)了免疫抑制對(duì)卵巢癌疾病發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。而S100A9是由MDSCs分泌的主要功能蛋白，其與S100A8蛋白形成復(fù)合物可以直接和NADPH氧化酶復(fù)合體成分結(jié)合，這種結(jié)合可以促進(jìn)MDSCs中NADPH氧化酶的激活從而增強(qiáng)ROS的產(chǎn)生，并引起抑制效應(yīng)。作者也在卵巢癌患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞以及血清中檢測(cè)到S100A8和S100A9的表達(dá)明顯高于健康人群。因此，可研究以S100A9為治療靶點(diǎn)，通過(guò)降低MDSCs的細(xì)胞數(shù)以及減少調(diào)節(jié)性酶ARG1和COX-2的表達(dá)，改善卵巢癌疾病的免疫抑制，從而緩解疾病的進(jìn)展。但是局限于本研究病例數(shù)有限，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大病例來(lái)驗(yàn)證這些因子能否作為治療的靶點(diǎn)。