延胡索丁素對(duì)大鼠心肌梗死的保護(hù)作用及機(jī)制研究

林岳 姜盈盈 呂望 金煥治 陳玲瓏

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）作為心血管急重癥，在臨床較為常見。因其冠狀動(dòng)脈阻塞持續(xù)影響心肌供血，最終誘導(dǎo)心肌壞死［1］。AMI具有發(fā)病急促、病情嚴(yán)重、病死率高等特點(diǎn)，可導(dǎo)致惡性心律失常、室間隔穿孔、心臟破裂或猝死等癥狀［2］。中醫(yī)藥對(duì)于心肌梗死的臨床治療具有悠久歷史，可通過多靶點(diǎn)、多途徑改善AMI后心肌損傷，增強(qiáng)心功能及緩解患者癥狀。中藥延胡索為罌粟科（Papaveraceae）紫堇屬（Corydalis）植物延胡索（Corydalis yanhusuo W. T. Wang）的干燥塊莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血散瘀、理氣止痛等功效，常用于胸脅、脘腹疼痛，胸痹心痛等治療［3］。研究發(fā)現(xiàn)延胡索具有良好的鎮(zhèn)痛、抗心律失常及改善冠心病等作用［4］。關(guān)于延胡索的化學(xué)成分研究始于上世紀(jì)20年代，延胡索丁素（Tetrahydrocoptisine，THC）作為其重要組成成分，具有良好的抗炎作用［5］。然而延胡索中THC對(duì)于AMI是否同樣具有良好的作用尚不清晰，因此本課題擬建立AMI大鼠模型，通過現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)深入考察延胡索丁素改善AMI的作用及機(jī)制，為延胡索的臨床應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8周齡SD健康雄性大鼠50只，體重平均（220±20）g，清潔級(jí)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011），購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠飼養(yǎng)于層流架中，12h晝夜交替，自由進(jìn)食飲水，保持恒溫。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器 延胡索丁素（HPLC≥98%，HT033199），寶雞市辰光生物科技有限公司；阿司匹林（HPLC≥98%，37655），美國(guó) Aladdin公司；cTnI、CK-MB、Myo相關(guān)ELISA試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），南京建成生物工程研究所；蛋白提取試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NLPR3、ASC及Caspase-1抗體，美國(guó)CST公司；ECL顯影試劑盒，美國(guó)GE公司；SDS-PAGE試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。小動(dòng)物呼吸機(jī)，上海奧爾科特生物科技有限公司；高分辨小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)，加拿大Visual sonics Inc公司；垂直電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)GE公司；MK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司。

1.3 模型建立 選擇40只大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）進(jìn)行麻醉，將其固定于手術(shù)臺(tái)并氣管插管進(jìn)行機(jī)械通氣。消毒手術(shù)區(qū)域，打開胸腔暴露心臟，在左心耳及右心室流出道間對(duì)冠脈左前降支（LAD）進(jìn)行結(jié)扎。當(dāng)結(jié)扎線以下心肌組織泛白發(fā)紺，同時(shí)心電圖檢查有≥2個(gè)導(dǎo)聯(lián)J點(diǎn)抬高＞0.2mm時(shí)，表明模型建立成功。將心臟送回胸腔，擠壓排除空氣，縫合胸骨、肌層與皮膚。

1.4 分組與給藥 將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、THC低劑量組（10mg/kg）、THC高劑量組（30mg/kg）、陽(yáng)性對(duì)照組（阿司匹林，30mg/kg）。另取10只已進(jìn)行手術(shù)但并未結(jié)扎的健康大鼠作為假手術(shù)組。各給藥組灌胃相應(yīng)藥物28d，假手術(shù)組給予等量生理鹽水。

1.5 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 給藥結(jié)束，大鼠腹腔麻醉后備皮并固定于手術(shù)臺(tái)，用小動(dòng)物超聲儀在17.5MHz對(duì)其檢測(cè)。主要檢測(cè)內(nèi)容包括：左心室收縮末期容積（LVESV）、左心室舒張末期容積（LVEDV）及左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），取其中連續(xù)6個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.6 ELISA法檢測(cè) 大鼠采用眼眶采血，靜置30min后低溫離心（3500 r/min）5min，分離上層血清并與-20℃保存。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）與肌紅蛋白（Myo）含量。

1.7 形態(tài)學(xué)考察 將大鼠脫頸椎處死，取其心臟。將部分心臟進(jìn)行切片（2mm），置入-20℃冷凍后，在20%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液中避光孵育15min。隨后進(jìn)行形態(tài)學(xué)考察，心臟梗死部位為灰白色，正常組織為紅色。采用Image J軟件計(jì)算梗死面積比例=梗死面積/（梗死面積+非梗死面積）×100%。隨后，從10%甲醛溶液中取出心臟組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、脫二甲苯、核染、分化與漂洗、染色、脫水、透明和封片，在光鏡下對(duì)心臟組織進(jìn)行考察。

1.8 Western bloting檢測(cè) 取心臟組織溶于裂解緩沖液中，根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)上樣緩沖液孵育后，各組取等量蛋白使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。經(jīng)5%BSA封閉后加一抗（NLPR3、ASC及caspase-1，1∶1000）在-4℃冰箱孵育過夜。次日在常溫條件下滴加二抗孵育30min，化學(xué)發(fā)光蛋白檢測(cè)試劑盒顯影成像。使用Image J軟件對(duì)各組蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量，β-Tubulin作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟超聲結(jié)果比較 見表1。

表1 各組大鼠超聲結(jié)果的比較（）

表1 各組大鼠超聲結(jié)果的比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01

組別 n LVEF（%） LVEDV（μl） LVESV（μl）假手術(shù)組 10 75.07±4.01 382.52±23.42 95.98±21.62模型組 10 61.49±5.0* 436.98±19.66* 167.61±14.39#THC低劑量組 10 67.46±2.76 429.28±36.67 139.96±19.29 THC高劑量組 10 71.96±3.97▲ 384.92±19.90▲ 107.40±9.99△陽(yáng)性對(duì)照組 10 73.34±5.45▲ 382.21±19.96▲ 101.16±15.81△

2.2 各組大鼠心臟指數(shù)及梗死比例的比較 見表2。

表2 各組大鼠心臟指數(shù)及梗死比例的比較［%，（）］

表2 各組大鼠心臟指數(shù)及梗死比例的比較［%，（）］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

組別 n 心臟指數(shù) 梗死比例假手術(shù)組 10 0.29±0.05 0.0±0.0模型組 10 0.46±0.05* 35.31±3.47*黃柏堿低劑量組 10 0.44±0.04 28.2±1.24#黃柏堿高劑量組 10 0.34±0.03# 19.1±0.90▲氨芐青霉素鈉組 10 0.33±0.03# 20.76±1.45▲

2.3 各組大鼠體內(nèi)心肌損傷標(biāo)志物含量比較 見表3。

表3 各組大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物含量的比較［μg/L，（）］

表3 各組大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物含量的比較［μg/L，（）］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01

組別 n CK-MB cTnl Myo假手術(shù)組 10 5.3±0.97 0.13±0.02 39.46±4.24模型組 10 65.17±7.72# 9.88±0.44# 51.90±4.55*THC低劑量組 10 42.11±4.58▲ 5.66±0.45△ 44.97±3.51 THC高劑量組 10 26.09±4.09△ 4.74±0.37△ 40.53±4.61▲陽(yáng)性對(duì)照組 10 23.04±2.61△ 4.71±0.37△ 41.97±3.51▲

2.4 各組大鼠心臟病理學(xué)改變的比較 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌纖維呈粉紅色、層次明顯、分布均勻，無(wú)心肌纖維化，未見心肌間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及梗死病灶等。模型組大鼠心肌組織梗死嚴(yán)重，病灶邊緣心肌纖維排列紊亂、斷裂，可見大量瘢痕及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥性充血等。THC低劑量組大鼠心肌細(xì)胞排列不清，細(xì)胞邊界模糊，可見部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及局部壞死等現(xiàn)象。THC高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，邊界清楚，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯壞死現(xiàn)象，細(xì)胞間質(zhì)可見輕度水腫。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織HE染色

2.5 各組大鼠心臟組織NLRP3、ASC及Caspase1蛋白表達(dá)比較 見表4、圖2。

表4 各組大鼠心臟組織NLRP3、ASC及Caspase1表達(dá)水平的變化（）

表4 各組大鼠心臟組織NLRP3、ASC及Caspase1表達(dá)水平的變化（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01

組別 n NLPR3/β-Tubulin ASC/β-Tubulin Caspase1/β-Tubulin假手術(shù)組 10 1.0±0.06 1.0±0.10 1.0±0.11模型組 10 2.34±0.08* 2.55±0.25# 1.89±0.17#THC低劑量組 10 1.96±0.13▲ 1.90±0.09▲ 1.47±0.20▲THC高劑量組 10 1.91±0.21▲ 1.24±0.09△ 1.19±0.16△陽(yáng)性對(duì)照組 10 1.75±0.14bb 1.51±0.24△ 1.27±0.16△

圖2 各組大鼠心臟組織NLRP3、ASC及Caspase1表達(dá)水平的變化

2.6 各組大鼠血清中IL-1β及IL-18含量的比較 見表5。

表5 各組大鼠腎血清IL-1β及IL-18含量的變化［pg/ml，（）］

表5 各組大鼠腎血清IL-1β及IL-18含量的變化［pg/ml，（）］

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01

組別 n IL-1β IL-18假手術(shù)組 10 17.31±3.16 22.63±2.36模型組 10 55.34±6.56* 74.13±7.29#THC低劑量組 10 42.16±4.59▲ 59.21±2.60▲THC高劑量組 10 27.34±4.29△ 34.37±5.25△陽(yáng)性對(duì)照組 10 30.37±2.44△ 31.58±3.57△

3 討論

急性心肌梗死是臨床常見危急重癥，其發(fā)病因素主要為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化狹窄，吸煙、飲酒、情緒激動(dòng)、過度勞累等，繼而導(dǎo)致心力衰竭、心功能不全及心律失常。該病通常嚴(yán)重影響患者身心健康，大幅降低患者生活質(zhì)量，是心血管疾病患者致死的關(guān)鍵誘因。中醫(yī)認(rèn)為，AMI屬“真心痛”、“厥心痛”及“胸痹”等范疇，其主要病機(jī)為痰濁、瘀血阻于心脈，閉塞不痛、營(yíng)氣不行等，主要治法以破瘀行氣及通絡(luò)止痛。延胡索具有活血散瘀、理氣止痛等功效，在AMI治療方面具有獨(dú)特療效。延胡索丁素是延胡索中重要成分，本研究通過建立AMI模型大鼠并給予延胡索丁素進(jìn)行干預(yù)，通過心臟超聲及心肌梗死面積繼而初步評(píng)價(jià)延胡索丁素的對(duì)大鼠AMI的影響。結(jié)果顯示，延胡索丁素可有效改善心臟心功能指標(biāo)，如：LVEF、LVEDV及LVESV，同時(shí)亦可縮小心肌梗死面積、降低心臟指數(shù)。由此提示，延胡索丁素具有緩解心肌梗死、逆轉(zhuǎn)心臟重塑及改善心功能不全等功效，具有重要的開發(fā)潛質(zhì)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展了進(jìn)一步的機(jī)制研究。

研究發(fā)現(xiàn)，AMI的治療時(shí)間與治療效果之間存在正相關(guān)性［6］，通常在AMI患者搶救治療中，務(wù)必采用早診斷、早治療原則，從而控制癥狀防范患者猝死及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。傳統(tǒng)AMI診斷主要通過對(duì)患者的心電圖及其臨床癥狀進(jìn)行分析，由于該方式特異性差，易出現(xiàn)漏診或誤診等情況，因此臨床上開始對(duì)患者體內(nèi)的心肌損傷標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。cTnI、CK-MB及Myo作為特征性血清學(xué)標(biāo)志物，在AMI診斷中具有重要的參考意義。cTnI是人體心肌細(xì)胞的一種調(diào)節(jié)蛋白，在健康人體血清中含量較低，當(dāng)心肌受損時(shí)釋放入血，具有較高的特異性及窗口期，其血清含量可直接表明AMI受損程度，因此被譽(yù)為心肌損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可作為心肌梗死的早期標(biāo)志物。CK-MB是AMI的典型標(biāo)志物，可特異性反映心肌損傷程度及治療溶栓效果。Myo廣泛分布于心肌及橫紋肌，當(dāng)AMI發(fā)生時(shí)可最早檢測(cè)出，Myo同時(shí)也是AMI溶栓成功再灌注的考察標(biāo)志物［7-8］。通過上述三項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，可有效判斷AMI的嚴(yán)重程度及相應(yīng)治療效果。通過形態(tài)學(xué)考察發(fā)現(xiàn)，延胡索丁素可保護(hù)、修復(fù)心肌細(xì)胞、減輕AMI后的心臟損傷，同時(shí)通過檢測(cè)血清生化指標(biāo)驗(yàn)證了延胡索丁素具有良好的改善心肌損傷作用。

炎癥反應(yīng)介導(dǎo)了AMI發(fā)生后的心肌損傷與修復(fù)的過程，通過緩解炎癥反應(yīng)可有效改善心肌梗死癥狀，降低梗死面積。本研究結(jié)果顯示，延胡索丁素可有效降低心臟組織中NLPR3、ASC及Caspase-1的表達(dá)水平，同時(shí)抑制其下游IL-1β、IL-18的合成與釋放。提示延胡索丁素可通過介導(dǎo)NLPR3/Caspase-1信號(hào)通路，減少炎癥因子的釋放，緩解AMI后心肌細(xì)胞的炎癥性損傷。