委陵菜酸改善前列腺癌的作用及機(jī)制研究

黃航 葉雪挺 楊宇 陳偉

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。在美國每年約有22萬例新增患者［1］，而我國前列腺癌患者發(fā)病率約為60.3/10萬，死亡率高達(dá)26.6/10萬［2］，嚴(yán)重影響老年男性的生活質(zhì)量，給社會家庭帶來巨大負(fù)擔(dān)［3］。通過手術(shù)、放療、化療及內(nèi)分泌干預(yù)等方法對前列腺癌患者進(jìn)行治療，但其療效不佳、周期長、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的治療效果及生命安全。因此，積極探索高效、低毒的抗癌新藥對提高患者生命健康具有重要意義。蛇莓是薔薇科植物蛇莓Duchesnea indica（Andr.）Focke的干燥全草，始載于《別錄》，其味甘、性苦寒，具有清熱解毒、散瘀消腫等功效，近年來其抗腫瘤活性日益獲得關(guān)注。本課題擬選用蛇莓中活性代表成分委陵菜酸作為研究對象，分別建立體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，對委陵菜酸在前列腺癌治療方面的作用及機(jī)制開展深入研究，為前列腺癌患者的治療提供新的有效方法，為傳統(tǒng)中草藥蛇莓的臨床應(yīng)用補(bǔ)充科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人前列腺癌LNCaP細(xì)胞，購自美國模式培養(yǎng)物保存中心（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），隨后置入含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱，每天進(jìn)行一次換液。

1.2 動物 SPF級雄性BALB/c-nu裸鼠（20.5～21.5g）40只，6周齡，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供［SCXK（京）2018-008］。裸鼠置于層流架中飼養(yǎng)。采用無特定病原體的飼料飼喂，溫度（23±2）℃，濕度45%～65%，維持10h光照、14h黑暗交替。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 委陵菜酸（HPLC≥98%，PRF7042741），購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；Gemini胎牛血清，購自美國Gemini公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，購自美國Hyclone公司；PSA、PPARβ、Twist1、E-cadherin、N-cadherin、vimentin及β-Tubulin抗體，購自美國Cell Signaling公司；HRP標(biāo)記抗兔二抗、蛋白抽提試劑盒及ECL發(fā)光液，購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；電子天平，美國Sartorius公司；細(xì)胞超凈工作臺，蘇州尚田生物技術(shù)公司；酶標(biāo)儀，購自美國Biotek公司，Western blot轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、Gel Doc凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；垂直電泳裝置，美國Bio-Rad公司。

1.4 方法 （1）劃痕實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞置入6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時用200μl移液槍頭在中間劃直線，確保每次劃痕寬度一致。采用無菌PBS液清洗孔內(nèi)脫落細(xì)胞，再加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并加入不同濃度（0、10、20及40μmol/L）的委陵菜酸進(jìn)行干預(yù)。分別在劃痕0h及24h后置顯微鏡下進(jìn)行觀測，評估細(xì)胞遷移情況，并根據(jù)劃痕愈合率對給藥前后細(xì)胞遷移能力進(jìn)行考察。（2）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞，將其稀釋至5×104濃度后取200μl加入包被有Matrigel的Transwell上室，各組孔內(nèi)分別滴加不同濃度（0、10、20及40μmol/L）的委陵菜酸進(jìn)行干預(yù)，同時在下室中加入完全培養(yǎng)基，隨后放置在細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束，用棉簽輕柔擦凈上室面未穿過膜層的LNCaP細(xì)胞，并置入甲醛進(jìn)行固定。20min后常溫晾干，采用結(jié)晶紫染色20min，用預(yù)冷的PBS進(jìn)行清洗，并放置顯微鏡下進(jìn)行觀測。（3）細(xì)胞內(nèi)蛋白收集：取對數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時進(jìn)行清洗、換液，并滴加不同濃度（0、10、20及40μmol/L）的委陵菜酸進(jìn)行干預(yù)，待培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，加入裂解液進(jìn)行低溫裂解。隨后收集至EP管中，根據(jù)12000r/min，4℃的條件離心5min，收集管內(nèi)上清液，分裝并保存于-80℃。（4）移植瘤模型建立［4］與給藥：收集對數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞，將其稀釋至2×107個/ml密度的細(xì)胞懸液。取健康BALB/c-nu裸鼠，術(shù)前12h禁食不禁水，用乙醚進(jìn)行吸入麻醉，仰臥位固定其頭部與四肢，下腹部消毒。隨后切開皮膚分離腹膜，用無菌棉簽推開膀胱使生殖腺葉狀肉紅色的左右葉前列腺腺體充分暴露。將25μl制備好的LNCaP細(xì)胞懸液注射在前列腺腺體的背外側(cè)薄膜內(nèi)。還原各組織器官位置，關(guān)閉腹腔、分層縫合皮膚。2周后，取造模裸鼠隨機(jī)分為移植瘤組、委陵菜酸低劑量（0.75mg/kg）組、委陵菜酸中劑量（1.50mg/kg）組及委陵菜酸高劑量（3.00mg/kg）組。各組灌胃相應(yīng)劑量藥物，移植瘤組給予等量生理鹽水，累計(jì)給藥4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死裸鼠并摘取前列腺腺體，剝離其中瘤組織待濾紙吸干后稱質(zhì)量（M）。測量瘤體的長（a）、短（b）徑。根據(jù)公式計(jì)算抑瘤率（%）=（M移植瘤組-M給藥組）/M移植瘤組×100%，瘤體積=（a×b2）/2。隨后將部分前列腺癌組織置入10%甲醛溶液固定。剩余部分組織剪碎，加入裂解液后勻漿。在4℃條件下12000r/min離心30min，取上層液至樣品管中，分裝后放置-80℃下保存。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 委陵菜酸對前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的作用 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與0μmo/L組比較，不同濃度（10、20、40μmol/L）委陵菜酸干預(yù)處理后，細(xì)胞遷移距離明顯縮減（P＜0.05，P＜0.01），其中以20μmo/L及40μmo/L的干預(yù)作用最強(qiáng)（P＜0.01）。結(jié)果見圖1。Transwell小室法結(jié)果表明：與0μmo/L組比較，不同濃度（20、40μmol/L）委陵菜酸干預(yù)處理后，細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），而10μmol/L組與0μmol/L組之間無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果見圖2。

圖1 委陵菜酸對LNCaP細(xì)胞遷移的影響

圖2 委陵菜酸對LNCaP細(xì)胞侵襲的影響

2.2 委陵菜酸對前列腺癌細(xì)胞中信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的作用 WB檢測細(xì)胞蛋白結(jié)果顯示：在PPARβ、Twist1、N-cadherin和Vimentin表達(dá)方面，與0μmol/L組比較，不同濃度（10、20、40μmol/L）委陵菜酸可明顯下調(diào)其表達(dá)水平（均為P＜0.05）；在E-cadherin表達(dá)方面，與0μmol/L組比較，不同濃度（10、20、40μmol/L）委陵菜酸可明顯上調(diào)前列腺癌細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01），其中以20及40μmol/L委陵菜酸作用能力最強(qiáng)（P＜0.01）；結(jié)果見圖3。

圖3 委陵菜酸對LNCaP細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 委陵菜酸對前列腺癌裸鼠移植瘤的作用 在前列腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型中，采用不同濃度（0.75、1.5、3mg/kg）委陵菜酸給藥治療后，各組腫瘤質(zhì)量及體積均出現(xiàn)了下降趨勢，與0mg/kg組比較差異明顯（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見圖 4。

圖4 委陵菜酸對裸鼠移植瘤的影響

3 討論

前列腺癌晚期患者通常采用雄激素去勢治療（androgen deprivation treatment，ADT）的治療方式，隨著治療的進(jìn)行而發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉(zhuǎn)移是前列腺癌患者死亡的重要原因，局限性前列腺癌患者的5年生存率可達(dá)100%，但一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移其5年生存率僅為31%［5］。而上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）在前列腺癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移與治療抵抗過程中起到關(guān)鍵作用，部分殘留的前列腺癌細(xì)胞在經(jīng)過激素療法后可表現(xiàn)出EMT表型。EMT能促進(jìn)上皮細(xì)胞極性消失、粘附能力降低，繼而轉(zhuǎn)化成具有移動能力的間質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞間緊密連接消失、細(xì)胞獲得遷移能力與侵襲能力。由此可知，抑制前列腺癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程對提高患者的生命具有重要意義。近年來，天然產(chǎn)物在抗腫瘤方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，通常具有療效強(qiáng)、毒副作用弱及不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，尤其在前列腺癌治療方面表現(xiàn)出獨(dú)特潛力。

研究表明，腫瘤細(xì)胞處于EMT進(jìn)程時其上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物（E-cadherin）表達(dá)受到抑制，而間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物（N-cadherin、vimentin）表達(dá)顯著增加，繼而使細(xì)胞間連接丟失、移動能力提升［6］。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，委陵菜酸可有效削弱前列腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，抑制癌細(xì)胞中N-cadherin、vimentin的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)。由此提示，委陵菜酸可通過調(diào)控EMT進(jìn)程，從而抑制前列腺癌細(xì)胞遷移、侵襲。Twist1是EMT進(jìn)程中重要的觸發(fā)因子，可調(diào)控E-cadherin或N-cadherin的表達(dá)［7］。Twist1在常見的各類腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中幾乎均有表達(dá)，在腫瘤EMT進(jìn)程及藥物抗性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］，而最新研究顯示Twist1亦參與了PPARβ的信號傳導(dǎo)［9］。PPARβ屬PPAR核激素受體超家族，體內(nèi)分布廣泛，通常參與脂類代謝、胚胎移植及腫瘤形成等生理病理過程，同樣在前列腺癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，是抑制前列腺癌細(xì)胞的重要靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，委陵菜酸可有效降低癌細(xì)胞中PPARβ及Twist1的表達(dá)水平，由此表明委陵菜酸對EMT的調(diào)控作用是通過介導(dǎo)PPARβ/Twist1信號傳導(dǎo)繼而發(fā)揮出來的。最后在人前列腺癌裸鼠移植瘤模型中，作者觀察到委陵菜酸可明顯降低腫瘤的質(zhì)量與體積，阻斷腫瘤組織的疾病進(jìn)展，此處研究結(jié)果與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。

綜上所述，委陵菜酸可有效抑制PPARβ/Twist1信號通路，從而緩解前列腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，下調(diào)其遷移與侵襲的能力。同時本實(shí)驗(yàn)從體外研究轉(zhuǎn)向體內(nèi)研究，充分驗(yàn)證了委陵菜酸抗前列腺癌的藥理活性及作用機(jī)制。因此，通過本研究為前列腺癌的臨床治療提供潛在策略，亦為蛇莓的傳統(tǒng)應(yīng)用補(bǔ)充了科學(xué)數(shù)據(jù)。