薏白湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的作用機(jī)制

師虹艷，張曉艷，霍永利，郭喜軍

(1.石家莊市中醫(yī)院，河北 石家莊；2.河北省中醫(yī)院,河北 石家莊)

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種異于尋常的免疫介導(dǎo)的腸道慢性、復(fù)發(fā)性、高發(fā)性炎癥性腸病，臨床常表現(xiàn)為左下腹、下腹部甚至全腹部陣痛、隱痛、灼痛、脹痛、酸痛，腹瀉、黏液膿血便等癥狀。病變可累及直腸、全結(jié)腸甚至末段回腸，其中乙狀結(jié)腸受累最明顯，病變主要局限于大腸黏膜與黏膜下層[1]。本文通過藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠，檢測血清中IL-4 水平和腸粘膜ODC 表達(dá)情況，探討薏白湯對濁毒內(nèi)蘊(yùn)型潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用薏白湯治療潰瘍性結(jié)腸炎提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar 雄性大鼠60 只，體重約(260 士20) g，購于醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證編號為SCXK(冀)2013-1-003。

1.2 動物飼料

大鼠喂養(yǎng)飼料為購于醫(yī)學(xué)院實驗動物中心的全價高營養(yǎng)顆粒，水為殺菌消毒過濾的純凈水。

1.3 實驗藥物

1.3.1 中藥

薏白湯的藥物組成：茯苓30g、白術(shù)6g、薏苡仁20g、葛根12g、升麻12g、秦皮12g、黃芩9g、黃連6g、地榆12g、陳皮12g、防風(fēng)12g、白芍12g 等。藥物為新綠中藥免煎顆粒，將該藥物放置于熱蒸餾水全部溶解，配制為5g/mL 的高濃度混懸液；2.5g/mL 的中濃度混懸液；1.25g/mL 的低濃度混懸液。

1.3.2 對照組藥物

美沙拉嗪腸溶片，產(chǎn)品規(guī)格為125mg，批號為130116。藥物研碎，過100 目篩，溶解純凈水中，配制成濃度為0.05g/mL的美沙拉嗪混懸液。

1.4 試劑

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，大鼠營養(yǎng)狀態(tài)較好，無死亡及生病現(xiàn)象，依照隨機(jī)數(shù)字表，將健康活潑Wistar 雄性大鼠均分為6組，分別為NN、M、MSLQ、HG、MG、LG。

2.2 動物模型制備

每組大鼠禁食水24 小時，稱體重、記錄、造模。以TNBS/乙醇復(fù)合法[2-3]建立UC 大鼠模型：將5% 的TNBS 與50%的乙醇溶液等體積比例混合成25mg(TNBS)/mL 混懸液，除NN 外，余組采用乙醚麻醉，待大鼠麻醉后將直徑約為0.2cm的硅膠管于肛門處插入大鼠結(jié)腸內(nèi)，深度(8 士1)cm，按照100mg(TNBS)/kg 注入0.5mL 混懸液，注入完畢后將大鼠倒置約30s，待混懸液充分深入到大鼠末端大腸，隨后將大鼠逐一歸籠，待其自然清醒，大鼠清醒后觀察無萎靡、狂躁、撕咬等現(xiàn)象，與NN 組大鼠相比，精神狀態(tài)相差無幾，提示造模成功。

2.3 藥物灌胃治療

NN組及M組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，不予處理。造模成功后第4天，準(zhǔn)備給予MSLQ、HG、MG、LG 藥物灌胃治療。給藥劑量根據(jù)正常成年人與大鼠體表面積比公式計算，MSLQ 組給0.05g/mL 美沙拉嗪混懸液，按體重400mg/(kg·d)，1 次/d；HG、MG、LG 組大鼠分別給予薏白湯高濃度混懸液，5g/mL，按體重32g/(kg·d)；中濃度溶液，2.5g/mL，按體重16g/(kg·d)；低濃度溶液，1.25g/mL，按體重8g/(kg·d)，均為1 次/d。灌胃給藥持續(xù)14 天。

2.4 標(biāo)本采集及處理

14 天后，藥物治療完畢，稱重、記錄。各組大鼠禁食水24h，取試管，編號，采取斷頭法處死大鼠，處死大鼠同時迅速留取4mL 大鼠血液置于相應(yīng)試管。待血液凝固后，置于TDL-5-A 離心機(jī)上，低溫轉(zhuǎn)速3000r/min，離心15min 后可以看到血清和血漿分離，此時取上層清液，置于-20℃下冷凍。后迅速用手術(shù)剪從大鼠腹部正中剖開，找出結(jié)腸組織，截取病變最明顯處，沿腸系膜縱軸剪開，置于生理鹽水中沖洗干凈，后放入40g/L 的多聚甲醛固定液中，固定待用。肉眼觀察結(jié)腸粘膜情況，可以看到結(jié)腸粘膜充血、糜爛、水腫、潰瘍、隱窩膿腫等，28h 后脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色。

2.5 指標(biāo)觀測

血清IL-4 含量采取放射免疫法，ODC 表達(dá)水平采取免疫組化法。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計量資料以(±s)表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，各組間采用單因素方差分析，兩組比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

表1 IL-4 和ODC 評分比較Table 3 CoMparison of the levels of IL-4 and ODC (±s)

表1 IL-4 和ODC 評分比較Table 3 CoMparison of the levels of IL-4 and ODC (±s)

注： coMpared with NN, △P＜0.05；coMpared with M, #P＜0.05；coMpared with LG , ☆P＜0.05；coMpared with MG, □P＜0.05；coMpared with HG,○P＜0.05。

Group N IL-4(pg/Ml) ODC NN 10 0.910±0.024 0.110±0.010 M 9 0.587±0.059 △ 0.135±0.006 △LG 9 0.683±0.053 △# 0.152±0.005 △#MG 10 0.737±0.067 △# 0.188±0.022 △#☆HG 9 0.831±0.045 △#☆□ 0.282±0.044 △#☆□MSLQ 9 0.742±0.073 △#○ 0.185±0.014 △#☆○

5 討論

目前，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制各家分說，病因復(fù)雜多變，病情纏綿難愈，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治愈性疾病之一[4]。

5.1 目前多認(rèn)為在中醫(yī)學(xué)上此病多屬“痢疾”“泄瀉”“腸澼”等范疇，認(rèn)為此病與飲食結(jié)構(gòu)、情志、氣候環(huán)境及遺傳等因素有關(guān)[5]。該病內(nèi)經(jīng)中稱“腸澼”?！端貑枴ぬ庩柮髡摗罚骸瓣栒?，天氣也，主外……下為飧瀉，久為腸澼”。宋·嚴(yán)用和在《濟(jì)生方·痢疾論治》中首稱其為痢疾，云“今之所謂痢疾者，古所謂滯下是也”。而隋·巢元方在《諸病源候論·痢病候》中將痢疾分為“冷熱痢”“休息痢”等21 種痢候病。清·吳瑭在《溫病條辨》中指出本病：“濕溫內(nèi)蘊(yùn)，夾雜飲食停滯……遂成滯下，俗名痢疾，古稱重證，以其深入臟腑也”, 對痢疾的病因病機(jī)進(jìn)行了論述。張仲景在《金匱要略》中云：“下利，便膿血者，桃花湯主之”“熱利下重者，白頭翁湯主之”“下利后更煩，按之心下濡者，為虛煩也，梔子豉湯主之”。指出濕熱、虛寒等痢疾的治法。明·李中梓《醫(yī)宗必讀·泄瀉》認(rèn)為“無濕不成瀉”，并提出治瀉九法。綜上所述，歷代醫(yī)家指出了本病的病因病機(jī)及治法方藥等。本病的基本病機(jī)為邪蘊(yùn)腸腑，氣血凝滯，傳導(dǎo)失司，脂膜血絡(luò)受損而成痢[6]，基本病變在腸，腸病及胃，《醫(yī)碥·痢》云：“不論何臟腑之濕熱，皆得以入腸胃，以胃為中土，主容受而傳之腸也。”其病理性質(zhì)有虛、實、寒、熱之分，且復(fù)雜多變，一般初病多為實，遷延日久則虛實夾雜，疾病后期常以虛為主。吾師根據(jù)其臨床經(jīng)驗總結(jié)認(rèn)為UC 病因病機(jī)復(fù)雜不單一，病情纏綿反復(fù)，不易根治。隨著社會發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)改變，嗜食肥甘之品較多，損脾傷胃；社會壓力較大，情志因素波動范圍較廣，影響肝之疏泄，肝胃不和，兩者均可使脾之運(yùn)化受損，胃腐熟功能降低，濕濁內(nèi)生；或先天脾胃虛弱，外感寒濕之邪不化，內(nèi)外濕邪膠結(jié)日久為濁為熱為瘀為滯，熱之漸化為毒，濁毒、血瘀、氣滯等蘊(yùn)結(jié)腸腑，敗濁始生，腸腑氣血滯澀不通，脂膜血絡(luò)受損，血肉腐敗。故本病病位在腸，與脾胃肝密切相關(guān)，且“濁毒”貫穿UC 疾病發(fā)生發(fā)展始終。在治療上強(qiáng)調(diào)化濁解毒、健脾除濕，恢復(fù)脾之健運(yùn)，胃納如前，濕自化，濁自消，毒自解。并根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)出薏白湯治療濁毒內(nèi)蘊(yùn)型潰瘍性結(jié)腸炎。藥物組成：黃芩9g，黃連6g，茯苓30g，白術(shù)6g，炒薏苡仁20g，葛根12g，升麻12g，秦皮12g，地榆12g，陳皮12g，防風(fēng)12g，白芍12g，甘草6g，飛揚(yáng)草9g，鳳尾草9g，葉下珠9g。具體方義如下：

5.2 方中黃芩、黃連清熱化濁解毒，善入脾胃清熱，一由肺下通三焦，一由胃及腸，為君藥，正如《素問·通評虛實論》所言：“五藏不平，六腑閉塞之所生也?！蓖ㄟ^瀉肺火以清大腸濕熱，《神農(nóng)本草經(jīng)》云：“主諸熱黃疸，腸澼瀉痢”[7]，現(xiàn)代藥理研究黃連中含有多種生物堿，如小檗堿可以抑制胃液分泌、抗腹瀉、抗腸道細(xì)菌、抗毒素等[8-9]。黃芩中含有黃芩苷等，可抗炎抗變態(tài)反應(yīng)，抑制腸管蠕動，抗氧化等[10]。茯苓、白術(shù)、炒薏苡仁健脾利濕化濁，為臣藥，《世補(bǔ)齋醫(yī)書》：“茯苓一味，為治痰主藥……痰之動，濕也，茯苓又可行濕”?，F(xiàn)代藥理顯示茯苓、白術(shù)可抑制潰瘍、降低胃液分泌、增強(qiáng)免疫力，此外白術(shù)還可雙向調(diào)節(jié)腸管活動，薏苡仁還可鎮(zhèn)痛。陳皮、防風(fēng)、芍藥三藥合用取痛瀉藥方之意，補(bǔ)脾瀉肝，緩?fù)粗篂a，吳鶴皋說：“瀉責(zé)之脾，痛責(zé)之肝”，白芍酸寒，養(yǎng)陰柔肝斂脾陰，緩急止痛白芍可通過抗氧化功能清除細(xì)胞表面的自由基而保護(hù)細(xì)胞活性，抗應(yīng)激抗炎，并可調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能[11]。陳皮歸脾肺經(jīng)，主治中焦寒濕脾胃氣滯所致的泄瀉，與白術(shù)、茯苓同用可治療便溏舌淡，故陳皮與諸藥起相輔相成之功。陳皮中含黃酮類成分可對胃腸平滑肌行雙向調(diào)節(jié)作用[12]。防風(fēng)味辛升清，微溫而燥濕，歸膀胱、肝、脾經(jīng)，可用于脾虛濕盛、清陽不升所致的泄瀉，即所謂《內(nèi)經(jīng)》云“濕勝則濡瀉”是也。現(xiàn)代藥理分析防風(fēng)中含有色原酮類、多糖類等，可有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎等作用，其中多糖類能提高機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)[13]。葛根、升麻二者相合善引脾胃清陽之氣上升而止瀉，在《日華子本草》：“止血痢，通小腸，排膿破血”，亦說明本品可以止痢。葛根中主要為黃酮類化合物，可改善微循環(huán)、提高機(jī)體免疫力、松弛腸道平滑肌等[14]。升麻味辛微甘，歸肺脾胃大腸經(jīng)，亦取其升舉陽氣之功，兩藥合用增強(qiáng)升陽止瀉止痢之功。升麻中含有升麻堿、升麻素等，抑制腸管痙攣，抑制5- 羥色胺誘導(dǎo)引起的腹瀉，并對大腸及痢疾桿菌起抑制作用[15-16]。秦皮清熱燥濕，善治濕熱下痢，現(xiàn)代藥理研究秦皮可抑制腸道細(xì)菌，抗炎[17-18]。地榆味苦酸澀，故可涼血止血，因其酸澀，故可澀腸而止痢，又因其性下降，故可治療下焦之便血、痔血。李時珍在《本草綱目》中云：“地榆治大小便血癥”。且研究顯示其收斂作用對潰瘍創(chuàng)面起護(hù)膜之效，煎劑可減輕組織水腫，抑制痢疾桿菌，明顯縮短出血及凝血時間[19]。飛揚(yáng)草、鳳尾草、葉下珠：飛揚(yáng)草歸肺膀胱大腸經(jīng)，可清熱解毒止痢，利濕，主治赤白痢疾，泄瀉等?！陡＝耖g草藥》云：“消癰解毒，利尿止痢”。吾師認(rèn)為飛揚(yáng)草、鳳尾草、葉下珠三藥合用可加強(qiáng)清熱解毒之功。飛揚(yáng)草主要化學(xué)成分為黃酮類、丹寧類等，具有抗炎、抗菌、抗病毒[20]。鳳尾草主要功效為清熱利濕，解毒止痢，涼血止血，鳳尾草有廣譜抗菌作用，可抗病毒。李燕等研究顯示鳳尾草有明顯的止血作用，可升高血小板，故可用于治療血小板減少性出血[21-22]。葉下珠治療赤白痢疾，暑熱痢疾。葉下珠可消炎、殺菌[23]，為佐使藥。炙甘草：甘草味甘性平,可增強(qiáng)補(bǔ)益心脾之功，在方中起調(diào)和諸藥作用。

縱觀全方，健脾與化濁并用，調(diào)和氣血并兼消積導(dǎo)致，導(dǎo)師強(qiáng)調(diào)：“人以胃氣為本，而治痢尤要”故顧護(hù)胃氣應(yīng)貫穿治療始終。全方結(jié)構(gòu)緊密，配伍得當(dāng)，共奏利濕化濁解毒之功。

5.3 目前國內(nèi)外醫(yī)學(xué)認(rèn)為，潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因尚未完全明確，難以根治并易反復(fù)發(fā)作的頑固性非特異性炎癥性腸病。王張學(xué)蘭等人[24]研究發(fā)現(xiàn)在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展過程中，抑炎與抗炎因子兩者動態(tài)平衡遭到破壞，促炎因子占據(jù)優(yōu)勢時，腸道黏膜遭到破壞，出現(xiàn)充血、潰瘍、糜爛等病變。結(jié)腸炎患者結(jié)腸粘膜有大量炎癥細(xì)胞浸潤，使用激素或者免疫抑制藥物干預(yù)后，癥狀可以有效緩解，病理組織學(xué)可以得到改善[27]?，F(xiàn)在研究表明中藥在修復(fù)腸道黏膜等方面具有很好的療效[25-26]。張斌等人[28]研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用活血化瘀、理腸通絡(luò)為主要原則治療潰瘍性結(jié)腸炎可以改善機(jī)體高黏狀態(tài)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力從而使瘀血祛，腸腑暢，潰瘍愈，張曉峰等[29]亦認(rèn)為UC 的炎癥程度與血液高黏狀態(tài)有關(guān)，血黏度越高炎癥越重，改善高凝狀態(tài)、提高機(jī)體免疫，清除細(xì)胞毒素和炎性產(chǎn)物，抑制腸黏膜異型增生，促進(jìn)腸粘膜愈合。余今菁等[30]試驗研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群失衡，腸黏膜免疫功能紊亂，繼發(fā)性引起致炎細(xì)胞因子/ 抑炎細(xì)胞因子紊亂。本實驗探討的IL-4 是來源于T 細(xì)胞的抑炎因子，其在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病發(fā)展中占據(jù)重要作用，其可抑制IL-1、TNF-α、超氧化物陰離子的形成，從而抑制IL-1的促炎作用[31]。王少鑫等[32]研究顯示在動物體內(nèi)病變結(jié)腸黏膜處抑炎因子表達(dá)明顯減少，聚集大量促炎癥因子，提示結(jié)腸炎癥處于進(jìn)展期。且多項人血清標(biāo)本檢測亦證實，血清炎癥因子水平可在臨床上評估潰瘍性結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度。

本實驗各組中，HG 組血清中IL-4 水平含量最高。在MG組、LG 組及MSLQ 組中含量均高于M 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。證明，薏白湯可以提高血清中IL-4 含量而抑制炎癥反應(yīng)。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC) 是多胺代謝中的關(guān)鍵酶，主要在結(jié)腸黏膜層表達(dá)，正常情況下幾乎不表達(dá)，損傷后修復(fù)時表達(dá)較強(qiáng)。李茹柳等[33]認(rèn)為ODC 在正常腸黏膜組織中表達(dá)較低，當(dāng)腸黏膜受損時ODC 活性明顯升高、含量上升，而當(dāng)受損腸黏膜進(jìn)入修復(fù)階段時，ODC 作為細(xì)胞增殖過程中的啟動因子之一，ODC 表達(dá)最強(qiáng)。在本實驗中，NN 組中大鼠結(jié)腸粘膜中ODC 幾乎不表達(dá)，M 組及LG 組中ODC 呈低表達(dá)，而在HG 組中ODC 高表達(dá)，與其余各組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。證明薏白湯可以上調(diào)結(jié)腸粘膜中ODC 表達(dá)而提高組織粘膜修復(fù)能力。

綜上所述，薏白湯治療濁毒內(nèi)蘊(yùn)型潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制可能是通過提高血清中IL-4 含量抑制炎癥反應(yīng)，提高結(jié)腸黏膜中ODC 含量而提高受損黏膜的修復(fù)能力。