應(yīng)用iTRAQ 技術(shù)篩選肺葉切除術(shù)患者單肺通氣前后血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)

張浩，李明，李鵬

(濰坊市益都中心醫(yī)院，山東 濰坊)

0 引言

單肺通氣(one-lung ventilation，OLV) 是一種經(jīng)支氣管導(dǎo)管僅利用單側(cè)肺( 非手術(shù)側(cè)肺) 進(jìn)行通氣的方法，一方面能夠隔離患側(cè)肺，避免患側(cè)肺對(duì)健側(cè)肺的污染，另一方面可以使兩側(cè)肺分別通氣，患側(cè)肺萎陷停止呼吸，為手術(shù)提供良好的視野。近年來(lái)，隨著胸外科手術(shù)的快速發(fā)展及胸腔鏡技術(shù)的推廣，OLV 的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[1]。但是OLV 期間術(shù)側(cè)肺的血液未能得到充分的氧合導(dǎo)致肺內(nèi)分流的增加，進(jìn)而引起肺組織缺氧，導(dǎo)致低氧血癥，造成肺組織細(xì)胞的損傷和功能損害。此外長(zhǎng)時(shí)間的肺萎陷、多次的肺復(fù)張以及術(shù)中手術(shù)操作對(duì)肺組織的牽拉、擠壓等也會(huì)對(duì)肺組織造成一定的程度的損傷，甚至可以引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(ventilator associated lung injury，VALI)導(dǎo)致肺部并發(fā)癥甚至死亡率的增高。iTRAQ 技術(shù)是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的一種可同時(shí)對(duì)八組樣本進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析的蛋白組學(xué)技術(shù)，結(jié)合多維液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)現(xiàn)已成為差異蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究的主要工具，廣泛的應(yīng)用于腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物的尋找等領(lǐng)域。本研究旨在利用iTRAQ 技術(shù)篩選肺葉切除手術(shù)患者單肺通氣前后發(fā)生差異表達(dá)的蛋白，為進(jìn)一步研究單肺通氣肺損傷的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

5800 MALDI-TOF/TOF 質(zhì) 譜 儀( 美 國(guó))、Nano-Tempo LC 點(diǎn)靶儀(加拿大)、iMark 型酶標(biāo)儀(美國(guó))、Agilent 1200 series 液 相 色 譜 儀( 美 國(guó))；iTRAQ 8 標(biāo)Buffer 試 劑 盒( 美國(guó))、iTRAQ 8 標(biāo)試劑盒(美國(guó))、胰酶(美國(guó)Promega 公司)、Agilent Buffer A 和B(美國(guó))、Multiple Affinity Removal System(MARS) Human 14 親和層析柱(美國(guó))。

1.2 樣本采集及分組

血清樣本取自2011 年3 月至2011 年10 月于東南大學(xué)附屬江陰市人民醫(yī)院胸外科行肺葉切除術(shù)患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：ASA Ⅰ或Ⅱ級(jí)；1 周內(nèi)無(wú)感染病史，無(wú)皮質(zhì)激素和抗生素使用史；患者肺功能正?；騼H有輕度的通氣功能障礙；無(wú)肝腎功能障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：因個(gè)體差異或者體位問(wèn)題導(dǎo)致雙腔管管口定位不良，血氧飽和度無(wú)法維持在90%以上；OLV 時(shí)間不足2h 或者大于4h；術(shù)中出現(xiàn)大的血流動(dòng)力學(xué)波動(dòng)。各例手術(shù)均采用相同的麻醉方法、麻醉機(jī)和監(jiān)護(hù)設(shè)備，由相同的麻醉醫(yī)生進(jìn)行操作。標(biāo)本采集經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者本人或

者家屬的知情同意，在手術(shù)開(kāi)始前和手術(shù)結(jié)束后即時(shí)取中心靜脈血5mL 于促凝管內(nèi)，分別記為OLV 術(shù)前組和OLV 術(shù)后組，室溫放置30min，4℃恒溫離心機(jī)3000r/min 離心20min，取上層血清，置于-80℃保存。

1.3 去除高豐度蛋白

-80℃保存的血清冰上復(fù)溶，各組的20 例樣本分別以5μl 等體積混合后，使用免疫親和色譜柱緩沖液A(Buffer A)稀釋4 倍，0.22μm 孔徑離心濾膜16000g 離心1min 去除顆粒物質(zhì)。單次上樣量80μl，應(yīng)用MARS HUMAN-14 免疫親和色譜柱去除血清中的白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白等14 種高豐度蛋白。過(guò)柱后得到的低豐度蛋白餾分采用5K MWCO 的離心濃縮器進(jìn)行濃縮，濃縮后采用BCA 定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.4 胰酶酶解和iTRAQ 標(biāo)記

各組樣本分別取100μg 蛋白進(jìn)行變性、還原、半胱氨酸修飾和胰酶酶解等處理后，采用iTRAQ 試劑進(jìn)行標(biāo)記OLV術(shù)前組和OLV 術(shù)后組分別采用113 和114 標(biāo)記。

表1 術(shù)前組和術(shù)后組比較，上調(diào)或者下調(diào)差異1.5 倍以上的蛋白質(zhì)

1.5 二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

標(biāo)記后的多肽混合物使用Spin Colum 進(jìn)行脫鹽處理后，應(yīng)用配有強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)色譜柱的液相色譜儀進(jìn)行第一維色譜分離，然后使用裝有反相-c18 柱的TempoTM LCMALDI 點(diǎn)靶儀進(jìn)行第二維反相色譜分離并點(diǎn)靶。點(diǎn)靶完成后使用MALDI-TOF/TOF 5800 型質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析使用ProteinPilot 軟件，搜索IPI 人類(lèi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。選擇可信度≧95%或者Protscore ≧1.3 的蛋白進(jìn)行報(bào)告，以113 為對(duì)照，比值≧1.5 或者≦0.67 作為閾值選取差異蛋白。差異蛋白的注釋和分類(lèi)使用DAVID 的功能注釋?zhuān)渲羞x擇GO(gene ontology)的生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能注釋對(duì)蛋白進(jìn)行分類(lèi)，選擇KEEG 的通路數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白所涉及的通路進(jìn)行分類(lèi)和富集分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Protein Pilot 軟件搜庫(kù)得到可信度大于95%即Unused Protscore ≧1.3 的蛋白189 種，其中差異表達(dá)的蛋白42 種，較通氣前上調(diào)的蛋白有20 種，下調(diào)的蛋白有22 種，見(jiàn)表1。

2.2 生物學(xué)功能分析

對(duì)單肺通氣過(guò)程中發(fā)生差異表達(dá)的42 種蛋白進(jìn)行基因功能聚類(lèi)分析(gene ontology，GO)和KEEG 通路分類(lèi)和富集分析后發(fā)現(xiàn)這42 種蛋白主要參加急性炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體系統(tǒng)的激活、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、蛋白水解作用、趨化反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程；細(xì)胞組分主要為血漿膜蛋白、核孔復(fù)合體、膜攻擊復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合蛋白等；分子功能主要以結(jié)合和催化功能為主；富集到的通路主要為趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路、凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)等。

3 討論

隨著對(duì)單肺通氣肺損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的深入，發(fā)現(xiàn)不論是缺血缺氧性損傷、機(jī)械牽張性損傷還是生物性損傷其對(duì)肺組織的損傷作用大都轉(zhuǎn)歸到細(xì)胞因子和趨化因子引起的炎癥反應(yīng)上，了解這些細(xì)胞因子或趨化因子的變化規(guī)律對(duì)更加深入的闡釋肺損傷的發(fā)生機(jī)制具有重要的意義。iTRAQ 技術(shù)能夠動(dòng)態(tài)、整體地考察疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中蛋白質(zhì)種類(lèi)、數(shù)量的改變，對(duì)進(jìn)一步闡釋疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。本研究利用該技術(shù)對(duì)肺葉切除手術(shù)患者單肺通氣前后的血清進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了42 種差異蛋白。

本研究結(jié)果中，單肺通氣后表達(dá)上調(diào)的蛋白中有3 個(gè)為急性相反應(yīng)蛋白，分別為α1-抗胰蛋白酶、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、C 反應(yīng)蛋白(CRP)。α1-抗胰蛋白酶由肝臟產(chǎn)生，是人體內(nèi)血清蛋白溶解酶的主要抑制物。正常人肺組織內(nèi)，分解肺組織的蛋白酶與抑制蛋白酶活性的α1-抗胰蛋白酶之間處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，從而維持肺組織正常的結(jié)構(gòu)免于破壞。當(dāng)肺部炎癥時(shí)，血清中中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞釋放出大量的彈性蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶，α1-抗胰蛋白酶也隨之升高。揭志軍[2]等研究發(fā)現(xiàn)預(yù)防性靜脈注射α1-抗胰蛋白酶能夠提高體內(nèi)抗蛋白酶的活性，減輕中性粒細(xì)胞蛋白酶(NE)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和血管屏障的損傷，減輕血管通透性的增高，使肺損傷減輕。C-反應(yīng)蛋白和SAA 是敏感的炎癥指標(biāo)，在白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6 和TNF 刺激下，由肝臟中被激活的巨噬細(xì)胞合成。Li[3]等人的研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)毒素導(dǎo)致的肺損傷模型中，CRP 發(fā)生了明顯的升高。Steven Bozinovsk[4]的研究認(rèn)為SAA可以作為慢性阻塞性肺部疾病急性發(fā)作的標(biāo)志物。

S100 A8 蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種低分子量鈣結(jié)合蛋白，具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及參與炎癥反應(yīng)等作用[5]。該蛋白主要由激活的中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞釋放，反過(guò)來(lái)在炎癥反應(yīng)時(shí)通過(guò)改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，增加白細(xì)胞變形的能力，使大量的白細(xì)胞通過(guò)變形滲透到反應(yīng)部位或聚集到微血管處，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大進(jìn)而加重?fù)p傷。此外，研究發(fā)現(xiàn) S100A8 蛋白同NFкB 和MAPK 通路也有著密切的關(guān)系。Szekanecz[6]等研究發(fā)現(xiàn)NFкB 通路抑制劑能夠明顯的抑制S100A8 介導(dǎo)的促炎因子的產(chǎn)生。Endoh[7,8]等研究發(fā)現(xiàn)鈣衛(wèi)蛋白同其受體RAGE 的相互作用可使P38MAPK、ERK 和SAPK/JNK 磷酸化導(dǎo)致激活進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。

凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1，簡(jiǎn)稱TSP-1)，是一種細(xì)胞外糖蛋白，可由多種細(xì)胞分泌，如肺泡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等。TSP-1 與TGF-β 有高度的親和性，能夠有效的促進(jìn)TGF-β 由潛在形式進(jìn)入激活狀態(tài)，它能夠促進(jìn)膠原纖維的產(chǎn)生和基質(zhì)沉淀，調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解酶的產(chǎn)生，具有重要的抗炎癥作用[9]。Sakurai[10]等研究發(fā)現(xiàn)阻斷TGF-β 的激活可以有效的減輕機(jī)械通氣導(dǎo)致的肺損傷，而TSP-1 為T(mén)GF-β 重要的激活因子。

本研究利用iTRAQ 技術(shù)構(gòu)建了肺葉切除術(shù)患者單肺通氣前后的差異表達(dá)蛋白圖譜，為進(jìn)一步的了解單肺通氣肺損傷的發(fā)病機(jī)制，并進(jìn)行早期的干預(yù)和治療提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)僅為初步研究，樣本量相對(duì)較少，所篩選出的一系列差異蛋白尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。