ABO正反定型不符病例基因測序分析1例

陳 瓊,黎勤云,朱長太

(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院東院輸血科,上海 201306;*通訊作者,E-mail:zct101@163.com)

ABO血型系統(tǒng)是最早發(fā)現(xiàn)的血型系統(tǒng),正確鑒定ABO血型是保證臨床輸血安全有效的前提。由于生理或病理原因引起ABO抗原或抗體減弱造成的ABO正反定型不符,常常會(huì)干擾ABO血型的正確定型,本文以1例血型鑒定出現(xiàn)混合視野進(jìn)行分析,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 病例報(bào)告

1.1 病例資料

患者,男,74歲,2019年12月9日夜間因上消化道出血伴高血壓入我院急診內(nèi)科就診?；颊咧囟蓉氀?呼吸急促,無輸血史,血常規(guī)檢查白細(xì)胞計(jì)數(shù)7.44×109/L,紅細(xì)胞1.42×1012/L,血紅蛋白42 g/L,血小板計(jì)數(shù)68×109/L。因患者血色素過低,夜班醫(yī)生申請輸紅細(xì)胞400 ml,輸血前進(jìn)行常規(guī)血型血清學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)ABO正反定型不符,正定型為抗-A混合視野,反定型B細(xì)胞4+,抗體篩查陰性。

1.2 試劑與儀器

凝聚胺試劑為珠海貝索公司生產(chǎn);ABO、Rh(D)血型定型檢測卡(微柱凝膠法)、低離子抗人球蛋白卡(微柱凝膠法)均為瑞士DiaMedGmbH生產(chǎn);抗A、抗B血型定型試劑(單克隆抗體)、抗-A1,抗-H、抗-AB試劑、RhD(IgM)血型定型試劑、抗人球蛋白(抗IgG,C3d)檢測試劑、人ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑、抗體篩選紅細(xì)胞檢測試劑(抗Ⅰ、抗Ⅱ、抗Ⅲ)均為上海血液生物有限責(zé)任公司生產(chǎn);用于配制紅細(xì)胞懸液的生理鹽水為山東華魯制藥有限公司生產(chǎn);Diamed-ID定速離心機(jī)、Diamed-ID 37 ℃孵育器為瑞士達(dá)亞美公司生產(chǎn);三用電熱恒溫水浴箱為常州翔天試驗(yàn)儀器廠生產(chǎn);KA-2200型離心機(jī)為日本久保田生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 血型正反鑒定試驗(yàn) 采用微柱凝膠正反定型血型法進(jìn)行檢測,后又采用試管法復(fù)查。試管法正定型加做抗-A1和抗-AB,反定型做ABO試劑紅細(xì)胞和自身對照,所有操作均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[1]進(jìn)行。

1.3.2 H抗原檢測 取玻璃試管一支,加入抗-H試劑和3%受檢者紅細(xì)胞懸液各1滴,3 400 r/min離心15 s,觀察結(jié)果。同時(shí)取新鮮成人B型紅細(xì)胞和O型紅細(xì)胞做強(qiáng)陽性和弱陽性對照,根據(jù)各血型紅細(xì)胞H抗原強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為O型>A2型>B型>A2B型>A1型>A1B型的特點(diǎn),判斷被檢者紅細(xì)胞H抗原是否增強(qiáng)。

1.3.3 不規(guī)則抗體篩查試驗(yàn) 用抗體篩選紅細(xì)胞檢測試劑(抗Ⅰ、抗Ⅱ、抗Ⅲ)對患者標(biāo)本進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查。

1.3.4 ABO基因測序 ABO基因測序根據(jù)ISBT網(wǎng)站提供的ABO(ISBT 001)等位基因v1.1 171023綜合結(jié)果判定(以A101為參考序列),由天津市秀鵬技術(shù)開發(fā)有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)檢測結(jié)果

血型血清學(xué)正定型抗-A檢測結(jié)果顯示:在微柱凝膠實(shí)驗(yàn)中可見兩群細(xì)胞,在鹽水介質(zhì)的試管法中為混合視野(見表1)?；颊哐鍖W(xué)檢測結(jié)果懷疑為ABO亞型,不能準(zhǔn)確定型,因此需通過分子生物學(xué)方法進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確定型。

表1 患者血型血清學(xué)反應(yīng)格局

方法 正定型反定型 抗-A抗-B抗-A1抗-AB抗-H抗-DA1cBcOc自身微柱法 mf0---4+04+00試管法 2+mf00mf2+4+04+00

mf:在微柱凝膠實(shí)驗(yàn)中可見兩群細(xì)胞,在鹽水介質(zhì)的試管法中為混合視野;-:未測;0:陰性

2.2 抗體篩查和抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抗體篩查、直接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)、間接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)抗體篩查實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性,排除ABO血型系統(tǒng)以外的不規(guī)則抗體;直接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)陰性,排除紅細(xì)胞上黏附的自身抗體對血型正定型的干擾;間接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)陰性,排除血清中存在干擾血型反定型的因素(見表2)。

2.3 ABO血型基因檢測結(jié)果

ABO基因1-7外顯子測序結(jié)果顯示第1-5外顯子未檢測到突變堿基,第6外顯子第261號(hào)堿基鳥嘌呤(G)缺失,第7外顯子第467號(hào)發(fā)生單個(gè)堿基替換,胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T),導(dǎo)致第156位氨基酸改變(Pro/Leu)(見圖1)。由此,ABO血型PCR-SSP分型結(jié)果證實(shí)此例患者ABO基因型為A102/O01。

表2 抗體篩查、直接抗球蛋白和間接抗球蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

反應(yīng)條件Ps+ⅠcPs+ⅡcPs+ⅢcPc+PsPc+抗人球蛋白(抗IgG,C3d)鹽水法00000凝聚胺法0000-微柱凝膠法0000-

Ps:患者血清;Pc:患者紅細(xì)胞;-:未測;0:陰性

圖1 ABO基因外顯子6和外顯子7測序結(jié)果

3 討論

紅細(xì)胞血型是指紅細(xì)胞膜上特征性抗原的類型。截止到2009年,國際輸血協(xié)會(huì)(ISBT)已經(jīng)確認(rèn)了308個(gè)特異性血型抗原,其中有270個(gè)分屬于明確的30個(gè)血型系統(tǒng)[2]。但ABO血型仍是人類血型系統(tǒng)中抗原免疫原性最強(qiáng)的一個(gè)血型系統(tǒng),因此ABO血型在輸血工作中是最重要的,也是最具有臨床意義的。正常情況下,ABO血型系統(tǒng)的抗原強(qiáng)度不會(huì)輕易發(fā)生改變[3]。由于紅細(xì)胞血型抗原表達(dá)發(fā)生改變或血清中抗體改變,都會(huì)使血型判斷困難或者判斷錯(cuò)誤,不能輕易輸血[4]。

本案例中,血清學(xué)檢測出混合視野(即紅細(xì)胞凝集成小凝塊,并被大部分游離的非凝集細(xì)胞包圍[5]),首先考慮排除其他原因造成的混合視野現(xiàn)象,如嵌合現(xiàn)象、并通過健康征詢排除移植史、白血病等疾病影響,患者近期無輸血史,排除了輸錯(cuò)血造成的混合視野現(xiàn)象。

雖然血清學(xué)懷疑為ABO亞型,但通過基因檢測技術(shù)確定了上述樣本為A型,基因分型為A102/O01。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道A102等位基因與A101等位基因相比只是在467位的單個(gè)堿基替換(C467T,Pro/Leu),兩者翻譯的糖基轉(zhuǎn)移酶活力沒有顯著性差異[6]。O01等位基因在第6外顯子nt261缺失,任何一個(gè)等位基因只要是包括了這個(gè)突變,不管它別的外顯子中(第4、6、7顯子)什么突變,都會(huì)導(dǎo)致ABO基因產(chǎn)物——催化乙酰半乳糖或半乳糖轉(zhuǎn)移到寡糖受體上的能力完全喪失。由于ABO基因的多態(tài)性,除了常見的第6、7外顯子上的基因突變引起抗原減弱外,第6、7外顯子以外的基因變異或轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)以及調(diào)控區(qū)域的異常都有可能導(dǎo)致A抗原減弱[6]。池泉等[7]報(bào)道ABO血型抗原的合成機(jī)制受多種因素影響,不同個(gè)體間即便含有相同的等位基因或突變也可能有著不同的血清學(xué)表現(xiàn)。所以進(jìn)一步研究這些領(lǐng)域的分子機(jī)制將有助于理解有相同等位基因的個(gè)體卻產(chǎn)生不同的血清學(xué)表現(xiàn)。

綜上所述,臨床上血清學(xué)方法是血型鑒定的經(jīng)典方法,適用于日常的血型定型工作。當(dāng)遇到血型正反定型不一致時(shí),不要輕易報(bào)告亞型,基因測序可以對患者血型進(jìn)行基因分型,并有可能發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。探討疑難血型的發(fā)生機(jī)制,是對血清學(xué)鑒定方法的有效且重要的補(bǔ)充。因此,在血型鑒定工作中將血清學(xué)鑒定和基因測序兩種方法有效結(jié)合,對于正確鑒定血型和保證臨床安全輸血具有重要意義。