人結(jié)腸癌組織中CAC1和Cyclin E的表達(dá)及其臨床意義

劉夢(mèng)潔,王文娟,郭 卉,焦 敏,姜麗麗,孔 鶯,張 曉

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:lingyinnancy@163.com)

結(jié)腸癌(colon cancer)是死亡率和發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一。全球范圍內(nèi)結(jié)腸癌發(fā)病率已位于男性癌癥第3位,女性癌癥第2位,每年新增病例120萬(wàn),每年死亡病例約為600 000例[1]。主要治療方法包括手術(shù)、放療、化療,以及靶向治療和免疫治療。盡管上述治療方法不斷改進(jìn),病死率有了明顯的下降,但在包括我國(guó)在內(nèi)的有些國(guó)家,其5年生存率仍低于50%[2]。因此,本研究擬尋找新的分子靶標(biāo)進(jìn)而更好地研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

細(xì)胞周期相關(guān)基因CAC1(CDK2-associated cullin 1)定位于人類(lèi)10號(hào)染色體的10q25-26,NCBI將CAC1歸于與細(xì)胞周期相關(guān)的Cullin家族[3]。CAC1在多種正常組織都有表達(dá),但表達(dá)程度不一。既往研究表明[4],CAC1在正常細(xì)胞的表達(dá)要低于腫瘤細(xì)胞,且與腫瘤細(xì)胞的惡性程度相關(guān);亦有文獻(xiàn)報(bào)道[5],CAC1可以與CDK2結(jié)合,自身表達(dá)增高可以促進(jìn)CDK2的活性增高,參與對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控,且主要在細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)揮作用,其與cullin家族中的cullin3同源性最高,有研究表明cullin3有助于Cyclin E的泛素化降解[6]。然而,盡管CAC1與cullin3同源,但有研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)Cyclin E的調(diào)節(jié)卻與之不同,Cyclin E也是參與細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變時(shí)的重要正性調(diào)節(jié)因子,在多種惡性腫瘤中,如喉癌[7]、膽囊癌[8]等,Cyclin E呈高表達(dá),其過(guò)度表達(dá)干擾了有絲分裂,形成的不穩(wěn)定染色體則是誘發(fā)腫瘤形成的可能機(jī)制之一。目前,雖然已有不少研究關(guān)注CAC1與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用,但聯(lián)合檢測(cè)CAC1和Cyclin E在結(jié)腸癌中的表達(dá)在國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。為探討CAC1和Cyclin E與結(jié)腸癌臨床病理因素之間的關(guān)系及兩者的相關(guān)性,本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP方法,檢測(cè)201對(duì)人結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中CAC1和Cyclin E的表達(dá),為進(jìn)一步研究CAC1和Cyclin E的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

標(biāo)本取自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科及腫瘤外科2011-01～2013-01手術(shù)切除后并經(jīng)病理證實(shí)的201對(duì)人結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織(距結(jié)腸癌遠(yuǎn)端5 cm以上),所有病例術(shù)前均未進(jìn)行化療和放療,其中男125例,女76例,年齡25-93歲(平均60歲,中位年齡62歲)。原發(fā)部位:右半結(jié)腸113例,左半結(jié)腸88例;低分化癌32例,中高分化癌169例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者80例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者121例;遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者28例,未遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者173例。根據(jù)美國(guó)抗癌協(xié)會(huì)聯(lián)盟(AJCC)第八版的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行國(guó)際TNM分期:Ⅰ期14例,Ⅱ期98例,Ⅲ期61例,Ⅳ期28例。標(biāo)本獲取已獲得西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò),所有患者均已簽署知情同意書(shū)。所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)100 ml/L中性甲醛液固定,石蠟包埋連續(xù)切片。

1.2 主要試劑

兔抗人多克隆抗體CAC1(GTX118514)購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司;鼠抗人多克隆抗體Cyclin E(sc-248)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;SP免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法和結(jié)果判定

采用免疫組化SP法檢測(cè),嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明步驟操作。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。CAC1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi);Cyclin E主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi),均表現(xiàn)為棕黃色或黃色顆粒。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,按腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞比例和著色強(qiáng)度分別進(jìn)行計(jì)分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):0%-5%為0分,>5%-25%為1分,>25%-50%為2分,>50%-75%為3分,>75%-100%為4分;染色強(qiáng)度無(wú)色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃褐色為3分。兩者得分乘積≥4分記為陽(yáng)性,<4為陰性。陽(yáng)性表達(dá)率為得分≥4分的病例數(shù)與總病例數(shù)的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAC1和Cyclin E在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,CAC1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平較高,主要表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒;在癌旁組織中表達(dá)水平很低,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,其在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為60.20%,明顯高于癌旁組織(19.40%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Cyclin E主要表達(dá)位于細(xì)胞核中,其在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為56.72%,顯著高于癌旁組織(11.94%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見(jiàn)圖1、表1)。

2.2 CAC1和Cyclin E的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征間的關(guān)系

將已獲取的201例結(jié)腸癌組織中CAC1和Cyclin E的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,CAC1在癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期相關(guān)(均P<0.05),與年齡、性別、原發(fā)部位、組織分化以及腫瘤浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān);Cyclin E的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(均P<0.05),與年齡、性別、原發(fā)部位、分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(見(jiàn)表2)。

A.CAC1在結(jié)腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá) B.CAC1在癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá) C.Cyclin E在結(jié)腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)D.Cyclin E在癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)圖1 CAC1和Cyclin E在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá) (SP,×400)Figure 1 The expression of CAC1 and Cyclin E in human colon tissues and paratumorous normal tissues (SP,×400)

表1 CAC1和Cyclin E在人結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá) 例(%)

Table 1 The expression of CAC1 and Cyclin E in human colon tissues and paratumorous normal tissues cases(%)

組別 n CAC1表達(dá)Cyclin E表達(dá)陽(yáng)性χ2P陽(yáng)性χ2P 癌組織 201 121(60.20)69.81<0.001114(56.72)88.81<0.001癌旁正常組織201 39(19.40)24(11.94)

表2 CAC1和Cyclin E的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征間的關(guān)系

Table 2 Relationships of CAC1 and Cyclin E expression with clinicopathological features in human colon tissues

臨床病理特征nCAC1表達(dá)Cyclin E表達(dá)陽(yáng)性例數(shù)χ2P陽(yáng)性例數(shù)χ2P 年齡0.4130.5210.1580.691 <60歲915753 ≥60歲1106461性別1.2430.2652.2460.134 男1257976 女764238原發(fā)部位2.1300.1443.0530.081 右半結(jié)腸1136358 左半結(jié)腸885856組織分化2.1660.1412.2450.134 低322322 中/高1699892腫瘤浸潤(rùn)深度3.7470.0532.5600.110 未超過(guò)固有肌層1877 超過(guò)固有肌層183114107淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6.7740.0094.9200.027 無(wú)1216461 有805753遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移4.5830.0320.5980.439 無(wú)17399100 有282214TNM分期12.988<0.0014.6480.031 Ⅰ/Ⅱ1125556 Ⅲ/Ⅳ896658

2.3 CAC1和Cyclin E在結(jié)腸癌組織中的相關(guān)性

對(duì)CAC1和Cyclin E在結(jié)腸癌組織中的相關(guān)性進(jìn)行分析,201例結(jié)腸癌組織中,CAC1表達(dá)陽(yáng)性而Cyclin E表達(dá)陰性的患者有28例,Cyclin E表達(dá)陽(yáng)性而CAC1表達(dá)陰性的患者有21例,兩者表達(dá)均為陽(yáng)性的患者有93例,兩者均不表達(dá)者有59例。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析CAC1和Cyclin E表達(dá)的相關(guān)性結(jié)果顯示,兩者的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.500,P<0.001,見(jiàn)表3)。

表3 CAC1和Cyclin E在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

Table 3 Correlation between CAC1 and Cyclin E expression in human colon cancer tissues

CAC1Cyclin E陽(yáng)性陰性rP陽(yáng)性93280.500<0.001陰性2159

3 討論

CAC1的最初發(fā)現(xiàn)是采用基因芯片技術(shù)分析直腸癌組織和正常直腸組織的基因表達(dá)差異,篩選發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)片段BM360862,隨后對(duì)差異片段進(jìn)行了克隆,得到了新基因C10orf46ky,Genbank登錄號(hào)為AY743663。CAC1定位于人類(lèi)染色體10q25-26,全長(zhǎng)6.7 kb,AY743663基因序列全長(zhǎng)4 335 bp,與CAC1 99%同源,不同的是其缺乏CAC1的3′末端,CAC1的ORF編碼369個(gè)氨基酸,分子量大小約為37 kD。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道該區(qū)段與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[9]。

既往研究表明,CAC1在乳腺癌、肺癌和胃癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá),而在人癌細(xì)胞系中,如結(jié)腸癌、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤、原始神經(jīng)外胚層腫瘤、前列腺癌、乳腺癌,也發(fā)現(xiàn)了其不同程度的高表達(dá)狀態(tài),且對(duì)這些腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期有一定的調(diào)控作用[5]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)獲取的201例結(jié)腸癌組織和對(duì)照的癌旁正常組織檢測(cè)了CAC1的表達(dá),結(jié)果顯示,CAC1在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織,且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期高者,CAC1的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組或TNM分期低者。說(shuō)明惡性程度高的腫瘤CAC1表達(dá)增多,提示CAC1可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用,其可作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。另外有研究表明[10],CAC1通過(guò)靶向miR-199a-5p參與結(jié)腸癌的耐藥問(wèn)題,而最近又有文獻(xiàn)再次印證了CAC1參與結(jié)腸癌耐藥的這一過(guò)程[11],這也為我們后續(xù)深入的機(jī)制研究提供了方向。

Cyclin E主要定位于細(xì)胞核,屬于細(xì)胞周期蛋白家族,是G1期的正向調(diào)節(jié)因子,其調(diào)控細(xì)胞增殖主要是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變,Cyclin E的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控從而形成腫瘤。既往研究表明,Cyclin E在宮頸癌[12]、結(jié)腸癌[13]、卵巢癌[14]、乳腺癌[15]、胃癌[16]等多種腫瘤中均有過(guò)表達(dá),并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移以及預(yù)后都密切相關(guān)。本研究檢測(cè)了Cyclin E在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān),并對(duì)CAC1與Cyclin E的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果顯示兩者顯著相關(guān),提示CAC1可能通過(guò)調(diào)控Cyclin E參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,這也與課題組既往研究結(jié)果相一致。

綜上所述,CAC1與Cyclin E在結(jié)腸癌組織中的高表達(dá)與結(jié)腸癌的惡性生物學(xué)行為如轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展密切相關(guān),這一結(jié)果為結(jié)腸癌的早期診斷及預(yù)后判斷提供了可能的新指標(biāo)。