正交試驗法優(yōu)選臍橙果皮中檸檬烯的超臨界流體CO2萃取工藝

李 運，白賀明，朱仁愿，邱國玉

（蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730050）

檸檬烯在天然植物中存在3種異構(gòu)體，最普遍的是D-檸檬烯，富含于蕓香科（Rutaceae）柑橘屬(Citrus L.)植物的果皮精油中。檸檬烯屬單萜類化合物，呈橙紅、橙黃色或無色澄清液體，有特異香氣；具有利膽溶石、理氣開胃、消炎止痛之功效，其制劑在臨床上用于治療膽道疾病[1]，國內(nèi)有十余家制藥企業(yè)生產(chǎn)相關制劑，具有極大的臨床應用潛力。現(xiàn)代藥理研究表明，D-檸檬烯具有抑菌[2]；調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂[3]；抑制癌細胞增殖，誘導細胞凋亡[4-8]；鎮(zhèn)痛及促進神經(jīng)中樞維持覺醒作用[9]；同時，能夠促進鹽酸川芎嗪的透皮吸收[10]。目前，臍橙皮多被人們當垃圾丟棄，其寶貴的應用價值被忽視，從臍橙皮中提取D-檸檬烯可使資源再生，變廢為寶。檸檬烯多通過水蒸氣蒸餾、分子蒸餾[11]、溶劑浸提等方法進行提取。本試驗以臍橙皮粗粉為研究對象，檸檬烯萃取率為評價指標，采用正交試驗優(yōu)選CO2超臨界萃取最佳工藝，為該資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料

Spe-ed型超臨界萃取儀（美國應用分離公司），GC-2010 Plus氣相色譜儀 （日本島津公司），MS105DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），BSA224S-CW型電子天平 (賽多利斯科學儀器（北京）有限公司)，CBL-10DT超聲波恒溫清洗機 （寧波新芝生物科技股份有限公司），DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海森信實驗儀器有限公司）。

臍橙購自江西贛州市，經(jīng)蘭州大學藥學院楊永建教授鑒定為蕓香科植物臍橙Citrus sinensis(L.)Osbeck的新鮮果實。去除果肉，將其果皮在日光下自然曬干，粉粹，過3號篩，備用。

檸檬烯對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號 100470-201302，純度：96.0%），無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 超臨界萃取工藝

稱取臍橙皮粉末適量，置提取釜中，連接管路，確保氣密性良好。設置萃取壓力、爐體溫度、出樣閥溫度，開機萃取，提取完成后從出樣閥獲得黃色液體狀提取物，稱定其重量。取適量，用無水乙醇溶解定容于25mL容量瓶，待上機測試。

2.2 檸檬烯的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取檸檬烯對照品181.41mg，置于100mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，即得。

2.2.2 色譜條件

Rtx-Wax彈性石英毛細管柱（0.32mm×30m，0.25μm）；柱溫：45℃；載氣：高純氮氣；進樣口溫度：220℃；色譜柱流量：1.38mL·min-1； 檢測器溫度：220℃； 進樣量：1μL；分流比：30：1。 理論塔板數(shù)按檸檬烯峰計算應不低于30000。色譜如圖1所示。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取超臨界萃取物0.0500g，置25mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關系考察

精密吸取檸檬烯對照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，2.0，5.0mL，分別置于25mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按2.2.2項下條件測定，以對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得回歸方程Y=565710X+41.8416（r=0.9999），線性范圍 0.003483～0.348308mg·mL-1。

圖1 空白試劑（A）、對照品（B）、供試品（C）的氣相色譜圖1.檸檬烯

2.2.5 精密度試驗

取濃度為0.055729mg·mL-1的檸檬烯對照品溶液，按2.2.2項下條件連續(xù)進樣6次，分別記錄峰面積，計算RSD為0.56%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.3”項下同一份供試品溶液，室溫下放置，0、2、4、6、12、18、24h 分別按“2.2.2”項下條件進行測試，計算出目標峰積分面積值的RSD為1.1%，可見供試品溶液至少在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗

精密稱取同一份超臨界萃取物5份，每份0.0500g，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項下條件進行含量測定。結(jié)果檸檬烯平均含量為16.9mg·g-1，RSD為1.2%，說明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的超臨界萃取物6份，每份60mg，分別精密加入檸檬烯對照品溶液（0.013932 mg·mL-1）2.0mL，置 25mL 容量瓶中，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析測定，計算回收率。結(jié)果檸檬烯平均回收率(n=6)為98.5%，RSD為1.7%。

2.2.9 樣品測定

取供試品溶液，分別進樣1μL，記錄檸檬烯峰面積，外標法計算含量。

2.3 正交試驗設計[12]

準確稱取臍橙皮粗粉10.00g，置超臨界萃取釜中進行萃取。在預實驗的基礎上，設定出樣閥溫度為100℃，選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時間為考察因素，每個因素設定3個水平，以檸檬烯萃取量為評價指標，因素水平見表1，試驗安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 臍橙皮中檸檬烯提取CO2超臨界萃取工藝正交試驗因素水平

直觀分析表明各因素對萃取工藝的影響程度依次為C＞A＞B；方差分析表明C因素對超臨界萃取工藝的評價指標有顯著性影響，A，B因素則無顯著性差異。確定最佳工藝條件為A2B2C3，即萃取溫度為40℃，萃取壓力為200bar，萃取時間為6h。

2.4 驗證試驗

取同批次樣品3份，按優(yōu)選的最佳提取工藝進行驗證試驗，測定檸檬烯的萃取率。結(jié)果提示檸檬烯的平均萃取率為18.70mg·g-1，RSD2.4%，說明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行。

表2 臍橙皮中檸檬烯提取CO2超臨界萃取工藝正交試驗結(jié)果

表3 檸檬烯萃取率方差分析

3 討論

1）夾帶劑的應用?？疾炝艘詿o水乙醇、甲醇作夾帶劑，對萃取率的影響。結(jié)果顯示，夾帶劑的應用，對于改變檸檬烯的萃取率無顯著性，故本研究在萃取工藝中未加入夾帶劑。

2）提取方式的選擇。檸檬烯較常用的是水蒸氣蒸餾法和有機溶劑浸提法，但這兩種方法受提取過程較高溫度的影響，會使精油中熱敏性化合物受熱分解或水解，降低了精油內(nèi)在品質(zhì)，造成餾分損失和有機溶劑殘留、萃取時間長、效率低等不足之處。而采用超臨界流體萃取技術(shù)，具有操作溫度低、有效成分不易被分解破壞、提取率高、無溶劑殘留等優(yōu)點，是“綠色化學”所倡導的技術(shù)。

3）以臍橙中精油為研究對象，進一步開展相關藥理活性研究，拓寬其應用空間，將提高該資源的深度開發(fā)利用，使其真正變廢為寶。