海洋氨氧化古菌及其驅動的碳氮生物地球化學循環(huán)過程研究進展*

洪義國，何翔，吳佳鵬，劉曉晗,2

(1 廣州大學大灣區(qū)環(huán)境研究院 珠江三角洲水質安全與保護教育部重點實驗室， 廣州 510006；2 廣州大學環(huán)境科學與工程學院， 廣州 510006)(2019年4月8日收稿； 2019年6月26日收修改稿)

氮是組成生命體的基本元素之一，同時氮循環(huán)也是自然界最基本的物質循環(huán)過程之一。早期地球上的氮循環(huán)由大氣反應和緩慢的地質過程控制，在大約27億年前，微生物代謝活動逐漸進化成為控制與調節(jié)地球氮循環(huán)的主要驅動力[1]。通過微生物的一系列作用，驅動氮在整個地球系統(tǒng)中循環(huán)，維持著整個生態(tài)系統(tǒng)中生命的延續(xù)和進化。通過長期的探索，科學家們初步建立了微生物氮循環(huán)途徑，主要包括固氮過程、硝化過程、反硝化過程、氨同化過程以及氨化過程。近年來，由于分子微生物學技術的進步，預測和鑒定了許多參與氮循環(huán)過程的新微生物種類。新的微生物及其代謝方式的闡明，使得氮生物地球化學循環(huán)理論也在經(jīng)歷不斷的修正和完善。細菌的厭氧氨氧化(anaerobic ammonia-oxidation, anammox)、古菌氨氧化(archaea ammonia-oxidation)、硝酸鹽異化還原到銨(dissimilatory nitrate reduction to ammonium, DNRA)以及全程氨氧化(complete ammonia-oxidation, comammox)的發(fā)現(xiàn)，改變了人們對微生物氮循環(huán)過程的傳統(tǒng)認知，構建了新的氮循環(huán)網(wǎng)絡體系[2-5]。本文主要針對氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)在海洋環(huán)境中的分布、AOA的氨氧化代謝機制、自養(yǎng)固碳機制及其在海洋生物地球化學循環(huán)中的作用等方面的研究進展進行綜述，以期對這個領域有更深刻更全面的認識。

1 海洋氨氧化過程概述

2 氨氧化古菌的發(fā)現(xiàn)

19世紀以前，人們把硝酸鹽看作是空氣中的氧和氨經(jīng)土壤催化生成的，是化學作用的產(chǎn)物。直到1890年，Winogradsky[7]利用無機鹽培養(yǎng)基成功分離純化獲得第一株具有氨氧化功能的細菌——歐洲亞硝化單胞菌(Nitrosomonaseuropaea)，證實氨氧化過程是由氨氧化微生物催化完成的。在此后的一百多年里，AOB被認為是自然環(huán)境中唯一具有氨氧化功能的微生物，對于氨氧化過程的研究也都是圍繞AOB開展的。Nitrosomonaseuropaea全基因組被測序之后，成為一種研究氨氧化微生物的生理生態(tài)、系統(tǒng)發(fā)育等方面的模式生物[8-10]，而編碼氨單加氧酶(ammonia mono-oxygenase, AMO)α亞基的amoA基因也從此作為分子標記物用于氨氧化細菌的分子生態(tài)學研究[11]。目前的研究結果表明，自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的AOB均歸屬于β-和γ-變形菌綱(Proteobacteria)[12-17]。

3 氨氧化古菌的多樣性及系統(tǒng)進化

基于16S rRNA同源性分析，DeLong[26]將從海水中獲取的環(huán)境樣品與可培養(yǎng)的古菌進行比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，將海洋浮游古菌劃分為4個分支：Marine Group I，屬于泉古菌類群；Marine Group II，III，和IV，屬于廣古菌類群。進化關系如圖1所示，其中Marine Group I被認為是海洋中分布最廣、數(shù)量最多的浮游古菌類群，被命名為中溫泉古菌(non-thermophilic Crenarchaeota)[27]。此后這類生活在中溫環(huán)境的泉古菌在土壤、河口、沉積物、海灣等諸多生境中都被發(fā)現(xiàn)廣泛存在。系統(tǒng)進化分析表明，氨氧化古菌也隸屬于中溫泉古菌。

但近來，隨著更多新的古菌小亞基核糖體 RNA(SSU rRNA)和大亞基核糖體 RNA(LSU rRNA)序列的獲得，研究者們對古菌的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，中溫泉古菌可能代表了一個新的獨立的進化分支。Robertson等[28]利用從GenBank下載的712條古菌SSU rRNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，以及Brochier-Armanet等[29]收集的226 個古菌和細菌的 SSU rRNA和 LSU rRNA基因序列進行的同源性分析，都發(fā)現(xiàn)在古菌域中的中溫泉古菌和嗜熱泉古菌形成了2個不同的單系群。緊接著，Brochier-Armanet對包括真核生物、細菌、廣古菌、嗜熱泉古菌和中溫泉古菌在內的53個具有全基因組的物種進行核糖體蛋白(r蛋白)的系統(tǒng)發(fā)育分析，并對Cenarchaeumsymbiosum進行比較基因組學分析，建議將中溫泉古菌獨立為古菌的一個門——奇古菌門(Thaumarchaeota)[29-30]。隨后，這一新提出的古菌門迅速得到其他研究證據(jù)的支持和認可。目前，奇古菌作為古菌中的一個單獨分支，包括屬于氨氧化古菌的Group I.1a和I.1b、來自酸性土壤的Group I.1c、來自開放海域的ALOHA Group、來自熱泉和熱液口的pSL12 Group和HWCGIII (hot water Crenarchaeotic Group III)以及來自地下礦井的SAGMCG-1，它們的系統(tǒng)進化關系如圖1所示。

圖1 奇古菌和其他古菌的系統(tǒng)發(fā)育分析[32]Fig.1 Phylogeny of thaumarchaeota and other archaea[32]

依靠傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法和現(xiàn)代的分子生物學手段，越來越多的氨氧化古菌被發(fā)現(xiàn)和鑒定(具體見附件表1)。針對目前這些已被分離或富集到的氨氧化古菌菌株，研究者們進行了基因組學和生理學等多方面研究，對這部分氨氧化古菌的基因組信息和生理學特性都有了一定的了解。但由于氨氧化古菌生長緩慢，代時長，目前來說仍有大部分的氨氧化古菌尚未被人們所認識和發(fā)現(xiàn)。Biller等[31]從GenBank中收集來自不同生境的8 296條AOA的amoA基因序列，當以90%的序列相似度作為界定新種的閾值時，得出自然環(huán)境中AOA的物種數(shù)為315個左右。這就意味著自然界中90%以上的AOA尚未被人類所認識。根據(jù)已知的氨氧化古菌16S rRNA和amoA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，目前已知的氨氧化古菌可分為4大簇：海洋中的Group I.1a、土壤中的Group I.1b、嗜熱的ThAOA和嗜酸的 Group I.1a-associated 4個類群。2012年Pester等[32]對NCBI、IMG/M和Camera 3個數(shù)據(jù)庫中收集的12 356條amoA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，提出氨氧化古菌可分為5個大簇，利用每個簇中已被分離或富集的氨氧化古菌的名字對該簇命名，包括有：Nitrosopumiluscluster、Nitrososphaeracluster、Nitrosotaleacluster、Nitrosocalduscluster，以及在當時還未有已知序列的Nitrososphaerasister cluster。

4 AOA的氨氧化代謝途徑及其在海洋中的生態(tài)分布

1992年，F(xiàn)uhrman等[39]和DeLong[40]分別在不同海域水體中發(fā)現(xiàn)，古菌在海洋水體中大量存在，且分布廣泛。此后的研究也表明海洋浮游古菌在海洋水體中占據(jù)著重要地位，尤其是在真光層以下的深層海水中數(shù)量更為豐富，在海洋中層及深層水體中，古菌占據(jù)海洋浮游微生物豐度的20%～40%[41-43]。而大部分的海洋浮游古菌都屬于中溫泉古菌(non-thermophilic Crenarchaeota)，即現(xiàn)在的奇古菌門(Thaumarchaeota)。因此可以推斷，相對于AOB，AOA在海洋水體中占據(jù)著優(yōu)勢地位。

Francis等[44]首先對海水和海洋底泥中AOA的多樣性和分布的普遍性做了探索，利用AOA-amoA基因特異性的引物對海水透光層、次氧層、河口和近海底泥等多個地點樣品中的AOA-amoA基因進行研究分析，發(fā)現(xiàn)在不同的海洋環(huán)境中存在不同的AOA群體，而且每個不同的取樣點都存在與環(huán)境相適應的特異性的AOA，但也存在一部分AOA種類在海洋中具有普遍性的分布。荷蘭皇家海洋研究所的Wuchter等[24]在針對北海及北大西洋的研究中，發(fā)現(xiàn)北海水體中AOA-amoA基因的豐度與海水中氨濃度的下降以及泉古菌的數(shù)量密切相關，而且古菌amoA的豐度比細菌的要高出1～2個數(shù)量級，對北大西洋水深1 000 m以上的水體中amoA基因豐度測定結果顯示，AOA的豐度也比AOB高1～3個數(shù)量級，這表明AOA在海洋硝化作用中可能發(fā)揮著重要作用。而宏轉錄組的分析結果也表明，在不同的海洋環(huán)境中，AOA氨氧化代謝都非常活躍[45-47]。Martens-Habbena等[25]通過對比原位測定的海洋氨氧化半飽和常數(shù)與實驗室測定NitrosopumilusmarinimusSCM1的氨氧化半飽和常數(shù)，發(fā)現(xiàn)二者在數(shù)值上相吻合，暗示AOA主導著海洋大部分的氨氧化反應。綜合以上研究可以看出，在大洋及寡營養(yǎng)的開闊海域水體中AOA數(shù)量多、多樣性高、分布廣，是海洋環(huán)境中氨氧化作用的主導群體，在海洋氮循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用。

5 AOA自養(yǎng)固碳的分子機制及其在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的功能

圖2 氨氧化古菌的氨氧化途徑驅動自養(yǎng)固碳[36, 50]Fig.2 Carbon fixing coupled with ammonia oxidation of ammonia oxidizing archaea[36, 50]

6 研究展望

近年來，分子生態(tài)學作為有力的工具促進了很多新的微生物生態(tài)學的認識。分子生態(tài)學的方法能夠使我們從基因水平了解AOA的多樣性及其參與的碳氮轉化機制。純培養(yǎng)AOA以及自然樣品的氨氧化率的測定使我們知道不同的AOA有不同的最適生理條件，因此生存在不同的生境中(ecological niches)。多種生理類型的AOA在廣泛不同的生態(tài)環(huán)境中是否都能以不同的菌群結構保證氨氧化活性？AOA的群體是以多大的時間尺度響應環(huán)境條件的改變？什么樣的環(huán)境條件改變最可能會影響環(huán)境的AOA氨氧化率以及固碳速率？AOA自養(yǎng)固碳為深海生物圈提供多少能量？生物地球化學和分子生物學的綜合方法將會為這些問題的解決提供思路。