結(jié)腸癌患者術(shù)前腸道菌群特征與術(shù)后腹瀉的關(guān)系研究*

張巍遠(yuǎn)，王玉柳明，張宇坤，王貴玉

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科 黑龍江哈爾濱 150081

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，近年來，隨著我國(guó)人民生活水平的提高與飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，死亡率在惡性腫瘤中排名前列[1-3]。人體腸道中各類細(xì)菌總數(shù)達(dá)1×1014，種類超過1 000種[4-5]，具有復(fù)雜的微環(huán)境。近年來多項(xiàng)研究表明，人體腸道菌群與結(jié)腸腫瘤的關(guān)系密切，兩者相互影響[6-7]。術(shù)后腹瀉是一種常見的結(jié)腸癌術(shù)后并發(fā)癥，然而術(shù)后腹瀉在不同個(gè)體可表現(xiàn)出明顯的差異性。因此本研究運(yùn)用微生物16S rRNA第二代高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的方法，嘗試對(duì)比結(jié)腸癌術(shù)后發(fā)生腹瀉患者與未發(fā)生腹瀉患者術(shù)前腸道菌群特征的異同，探究患者術(shù)前腸道微生物特征與術(shù)后腹瀉的關(guān)聯(lián)性，尋找導(dǎo)致術(shù)后腹瀉的可能原因，為防治術(shù)后腹瀉提供新的治療靶點(diǎn)與方向，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究納入2018年7月至2019年1月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科就診并進(jìn)行根治性手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者為研究對(duì)象，初始共收集研究樣本65例，其中術(shù)后腹瀉患者33例、術(shù)后未腹瀉患者32例。術(shù)后腹瀉患者入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）通過腸鏡病理活檢診斷為原發(fā)性結(jié)腸惡性腫瘤；（2）進(jìn)行原發(fā)灶根治切除手術(shù)；（3）術(shù)后排便次數(shù)≥3次/日，糞質(zhì)變稀，無明顯膿血；（4）可伴有腹痛、腹脹、里急后重、發(fā)熱等癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）樣本采集前3個(gè)月內(nèi)曾服用抗生素或皮質(zhì)類固醇激素或益生菌者；（2）樣本采集前1周內(nèi)行灌腸治療或腸鏡檢查或口服導(dǎo)瀉劑者；（3）細(xì)菌性痢疾、腸道寄生蟲、胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌瘤所致腹瀉、腸結(jié)核、炎癥性腸病以及胰源性腹瀉；（4）特殊飲食者。本研究采用傾向值匹配法（PSM），將患者的性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、腫瘤部位和美國(guó)麻醉師協(xié)會(huì)（ASA）評(píng)分作為變量，運(yùn)用Logistic回歸模型分析變量所得出P值即為傾向值。按照最鄰近匹配法（NNM）進(jìn)行1:1配對(duì)，將卡鉗值設(shè)置為0.01對(duì)患者進(jìn)行篩選，經(jīng)PSM后選出腹瀉組（D組）與對(duì)照組（C組，未發(fā)生術(shù)后腹瀉）患者各19例，見表1。本項(xiàng)研究通過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，所有研究對(duì)象均同意采集樣本并已簽署書面形式的知情同意書。

表1 傾向值匹配結(jié)果

表1（續(xù)）

1.2 樣本采集與處理

所有新鮮糞便樣本（≥1 g）均于研究對(duì)象入院當(dāng)天未經(jīng)任何醫(yī)療處置前收集，樣本收集于無菌凍存管內(nèi)，放置于液氮中速凍后儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)。糞便樣本細(xì)菌的DNA的提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)）。具體步驟按照說明書操作，所提取的DNA于-80℃冰箱保存。對(duì)樣本的16S rRNA的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用的引物序列為338F5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建成測(cè)序文庫，并使用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行測(cè)序（測(cè)序部分由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成）。

1.3 生物信息學(xué)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用軟件FLASH、Trimmomatic對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以97%相似度聚類得到操作分類單元（opera?tional taxonomicunits，OUT）結(jié)果，在OUT水平對(duì)各組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行傾向值匹配法與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；符合偏態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用M（QL，QU）表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。對(duì)于計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（n）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本分組分析

相似性分析（ANOSIM分析）結(jié)果R值為0.52、P值為0.001，采用unweighted_unifrac的方法計(jì)算組間或組內(nèi)距離值，并將組內(nèi)及組間距離值的結(jié)果繪制成盒狀圖（見圖1）。兩者提示了分組的正確性并且滿足可進(jìn)一步分析兩組間差異的條件。

2.2 菌群組成分析及組間差異檢驗(yàn)

首先從細(xì)菌“門”水平對(duì)兩組樣本進(jìn)行群落分析：腹瀉組豐度排前3位的分別是厚壁菌門（Fir?micutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Pro?teobacteria），分別占45.6%、24.4%、17.7%；對(duì)照組豐度排前3位的也是這三者，分別占48.8%、38.7%、8.8%。兩組的優(yōu)勢(shì)菌種相同，但所占比例不同（見圖2）?；趦山M各菌群豐度進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)并繪制柱狀圖（見圖3），可見疣狀菌門（Verruco?microbia）在腹瀉組中豐度增多（P＜0.05），擬桿菌門（Bacteroidetes）與柔膜菌門（Tenericutes）的豐度在對(duì)照組更多（均P＜0.05）。

其次從細(xì)菌“屬”水平對(duì)兩組樣本進(jìn)行群落分析：腹瀉組豐度排前5位的分別是擬桿菌屬（Bacte?roides）、大腸桿菌志賀菌屬（Escherichia Shigella）、腸球菌（Enterococcus）、梭菌屬（Fusobacterium）、枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter），分別占20.7%、11.1%、7.7%、4.7%、3.1%；對(duì)照組豐度排前5位的分別是擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃菌屬（Prevotella_9），大腸桿菌志賀菌屬（Escherichia Shigella）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、瘤胃球菌屬（Ruminococca?ceae-UCG-002），分別占15.3%、9.8%、6.7%、5.3%、3.9%。在菌屬水平對(duì)比群落組成，兩組間群落組成比例不同（見圖4）。進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)并繪制柱狀圖（見圖5），可見腸球菌屬（Enterococcus）在腹瀉組中豐度增多（P＜0.05），普雷沃菌屬（Pre?votella_9）與直腸真菌（Eubactaerium rectale）的豐度在對(duì)照組更多（均P＜0.05）。

圖1 組間及組內(nèi)距離值盒狀圖

圖2 兩組間腸道細(xì)菌“門”水平群落組成對(duì)比

圖3 兩組間腸道細(xì)菌“門”水平差異檢驗(yàn)柱狀圖

圖4 兩組間腸道細(xì)菌“屬”水平群落組成對(duì)比

圖5 兩組間腸道細(xì)菌“屬”水平差異檢驗(yàn)柱狀圖

2.3 多樣性分析

首先對(duì)兩組進(jìn)行Alpha多樣性分析：計(jì)算Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)并進(jìn)行對(duì)比，可得出兩組間豐度有差異，計(jì)算出辛普森（Simpson）指數(shù)、香農(nóng)（Shannon）指數(shù)進(jìn)行對(duì)比，可得出兩組間物種多樣性有差異，見表2。在OUT水平繪制組間差異檢驗(yàn)直方圖，結(jié)果提示兩組間物種多樣性存在差異（P＜0.001），見圖6。

其次采用PCoA分析方法對(duì)兩組進(jìn)行Beta多樣性分析，應(yīng)用unweighted_unifric算法，可見兩組樣本主成分存在差異（P＜0.01）。見圖7。

表2 Alpha多樣性指數(shù)表

圖6 組間差異檢驗(yàn)直方圖（***表示P＜0.001）

圖7 PCoA（主坐標(biāo)分析圖）

3 討論

人體腸道內(nèi)的微生物環(huán)境極其復(fù)雜，包含多種微生物，其中細(xì)菌占據(jù)了絕大多數(shù)。隨著二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，近年來越來越多的研究關(guān)注腸道菌群與結(jié)直腸癌間的關(guān)聯(lián)及影響[8-12]。結(jié)腸癌手術(shù)患者不同于其他腸道手術(shù)或腹腔手術(shù)的患者，其體內(nèi)的腸道菌群與非癌癥患者差異性較大。既往的研究大多關(guān)注于腸道細(xì)菌對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響，或健康人群與結(jié)腸癌患者間的對(duì)比，而關(guān)于腸道菌群與術(shù)后并發(fā)癥的關(guān)系研究鮮有。本研究以結(jié)腸癌手術(shù)后常見的術(shù)后并發(fā)癥——術(shù)后腹瀉為研究?jī)?nèi)容，利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)比術(shù)后發(fā)生腹瀉患者與未發(fā)生腹瀉患者的術(shù)前腸道菌群特征差異，試圖從腸道微環(huán)境差異的角度解釋患者術(shù)后腹瀉原因。

引起患者腹瀉的原因很多，包括細(xì)菌性痢疾、腸道寄生蟲、胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌瘤所致腹瀉、腸結(jié)核、炎癥性腸病以及胰源性腹瀉等。通過嚴(yán)格的入組與排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究將其他原因?qū)е赂篂a的患者排除，便于進(jìn)一步探究術(shù)前腸道菌群與術(shù)后腹瀉的關(guān)聯(lián)性。

本研究對(duì)比既往的研究有兩點(diǎn)不同：（1）既往的研究多選用腸道黏膜或者腫瘤組織作為測(cè)序?qū)ο?，但是通過手術(shù)或者腸鏡等方式獲取腸道黏膜組織，破壞了原有的腸道菌群的組成。本研究選用糞便樣本作為測(cè)序?qū)ο?，腸道中大部分定殖菌在糞便的形成過程中被沖刷下來，并且未破壞原有的腸道菌群環(huán)境[13-14]；（2）既往研究中的研究對(duì)象大部分為隨機(jī)選取某一時(shí)段的入院患者，在對(duì)比組間菌群差異時(shí)無法排除選擇偏移和個(gè)體基本信息差異。本研究使用了傾向值匹配法，兩組研究對(duì)象間的基礎(chǔ)狀況更相近，使組間對(duì)比的結(jié)果可信度更高。

利用相似性分析的方法確認(rèn)分組對(duì)比有意義后，Alpha多樣性分析與PCoA分析提示兩組菌群組成成分不同且差異明顯。最后分別對(duì)兩組樣本在“門”“屬”水平進(jìn)行群落分析和差異性檢驗(yàn)，術(shù)后腹瀉的患者其術(shù)前腸道內(nèi)的疣狀菌門和腸球菌屬豐度增高，擬桿菌門豐度減少。雖然結(jié)腸癌術(shù)后腹瀉的病因仍不明，但腸道菌群失調(diào)被認(rèn)為是可能導(dǎo)致其發(fā)生的原因之一[15]。由于腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致腸內(nèi)微生物的種類、含量、比例的改變，腸道內(nèi)益生菌減少，對(duì)腸道黏膜的保護(hù)作用減弱，而致病菌增多，其釋放的內(nèi)毒素可以損傷腸道黏膜屏障，使黏膜通透性增加并產(chǎn)生局部炎性反應(yīng)。腸道菌群失調(diào)也可以使腸內(nèi)結(jié)合膽汁酸鹽水解增多，影響脂質(zhì)與脂肪的消化吸收，從而導(dǎo)致腹瀉。此外，擬桿菌門中的非腸毒素脆弱擬桿菌被證明有減少炎癥介質(zhì)分泌、降低機(jī)體炎癥反應(yīng)的功能[16]，由于測(cè)序技術(shù)的限制無法區(qū)分非腸毒素脆弱擬桿菌與其他擬桿菌的具體含量差異，因此本研究推測(cè)非腸毒素脆弱擬桿菌的減少可能是造成術(shù)后腹瀉的原因之一。

基于本研究認(rèn)為，結(jié)腸癌術(shù)后發(fā)生腹瀉的患者其術(shù)前腸道菌群特征可見有異于術(shù)后未發(fā)生腹瀉的患者，腸道菌群的失調(diào)可能是導(dǎo)致腹瀉發(fā)生的原因。其中疣狀菌門和腸球菌屬組間差異明顯，且既往研究顯示疣狀菌門與腸球菌屬都可能對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[17-18]。除擬桿菌門中的非腸毒素脆弱擬桿菌外，造成結(jié)腸癌患者術(shù)后腹瀉的病因也可能與疣狀菌門和腸球菌屬在不同個(gè)體間含量的差異相關(guān)。因此，在術(shù)前注重對(duì)患者腸道菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)，可能成為預(yù)防結(jié)腸癌術(shù)后腹瀉發(fā)生的新的思考方向。