H3K79me2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系*

沈韌斌，陳汝蕾，陳俊杰，沈銘紅，蔣燕南，張研，武冠廷，王臨池，黃瑾瑜，陳國梁，呂京澴，顧新華，何宋兵△

1 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科 江蘇蘇州 215000

2 蘇州市立醫(yī)院本部/南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院普外科 江蘇蘇州 215000

3 蘇州市立醫(yī)院本部/南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院病理科 江蘇蘇州 215000

4 蘇州市疾病預(yù)防控制中心慢病科 江蘇蘇州 215000

5 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院影像科 江蘇蘇州 215000

6 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部 江蘇蘇州 215000

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球范圍內(nèi)各種惡性腫瘤的發(fā)病率、病死率中結(jié)直腸癌分別位居第三位和第二位[1]，我國2018年結(jié)直腸癌新增病例已超過52萬例，新增死亡病例超過24萬例[2]。目前結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)治療為主的綜合治療，五年生存率雖然逐步改善，但仍然不是十分令人滿意[3]。尋找結(jié)直腸癌敏感度和特異度較好的診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)是目前研究的方向，以提高早期診斷率及治愈率。癌基因和抑癌基因等遺傳學(xué)的改變參與腫瘤的形成，而表觀遺傳學(xué)改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展同樣密不可分。組蛋白甲基化是一種重要的組蛋白修飾形式，可導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)的改變，組蛋白H3和H4基團(tuán)的具有不穩(wěn)定性的N’末端精氨酸和賴氨酸殘基是被甲基化修飾的主要位點(diǎn)[4]。而組蛋白H3基團(tuán)第79號賴氨酸（histone H3 lysine 79 peptide，H3K79）是位于組蛋白的核心球體表面的賴氨酸位點(diǎn)，類端粒沉默1干擾體（disruptor of telomeric silencing 1-like，DOT1L）是唯一催化它的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，又稱組蛋白H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶（histone H3 lysine 79 methyltransferase）[5]。甲基化過程通常由S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-lmethionine,SAM）提供甲基，經(jīng)DOT1L催化，可使79號賴氨酸發(fā)生一、二、三甲基化，形成相應(yīng)的一甲基化H3K79（monometh?yl histone H3 lysine 79 peptide，H3K79me1）、二甲基化 H3K79（dimethyl histone H3 lysine 79 pep?tide，H3K79me2）、三甲基化H3K79（trimethyl his?tone H3 lysine 79 peptide，H3K79me3）三種甲基化產(chǎn)物[6]。DOT1L已逐漸被認(rèn)為是一類潛在的癌基因，但H3K79的甲基化狀態(tài)研究仍較少，相關(guān)研究表明，H3K79甲基化參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生理過程，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。但H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3三種甲基化狀態(tài)的生理功能不完全相同，最近有研究證明H3K79me3參與DNA雙鏈斷裂的修復(fù)[8]，而另外有研究發(fā)現(xiàn)H3K79me2參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，它在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中富集于癌基因c-Myc啟動子的-6682～+284區(qū)域，抑制DOT1L可使H3K79me2富集量下降[9]。H3K79甲基化在結(jié)直腸癌組織中的研究仍較少，H3K79me2被認(rèn)為與腫瘤關(guān)系密切。本研究通過免疫組化的方法檢測結(jié)直腸癌組織中H3K79me2的表達(dá)量，并分析其與臨床病理特征及生存預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取蘇州市立醫(yī)院本部/南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院2012年5月至2014年12月行結(jié)直腸癌手術(shù)治療的78例手術(shù)病例為研究對象。該組結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征資料及預(yù)后數(shù)據(jù)完整，組織標(biāo)本的石蠟塊保存良好，按WHO標(biāo)準(zhǔn)將腫瘤組織病理分化程度分為高、中、低分化。其中男性42例，女性36例；年齡34～90歲，≥60歲者58例，＜60歲者20例；病理類型均為腺癌，分化程度為高-中分化者59例，低分化者19例；直腸癌11例，左半結(jié)腸癌29例，右半結(jié)腸癌38例；有脈管侵犯者18例，無脈管侵犯者60例；腫瘤T分期，T1～T2期者32例，T3～T4期者46例；腫瘤N分期，有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例；腫瘤M分期，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者（M1）9例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者（M0）69例；腫瘤TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期者36例，Ⅲ～Ⅳ期者42例。外周血癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）檢驗(yàn)值為5.0（2.4，16.9）ng/mL，分為正常組40例和升高組38例。本研究獲得蘇州市立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)術(shù)前CT、腸鏡等診斷為結(jié)直腸癌的患者，行根治性手術(shù)治療，術(shù)后均有明確病理類型及分化程度；（2）肝腎等重要臟器功能良好；（3）無其他臟器及血液系統(tǒng)腫瘤史；（4）術(shù)前均未行新輔助放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能損害者；（2）合并其它臟器惡性腫瘤者；（3）伴有急性及慢性全身嚴(yán)重感染者；（4）伴有精神疾病者；（5）妊娠期及哺乳期婦女；（6）在治療過程中死亡者。

1.3 免疫組化方法

結(jié)直腸癌組織標(biāo)本用福爾馬林固定，經(jīng)脫水、包埋，石蠟塊切片厚度為3 μm，經(jīng)60℃烘片2 h左右；常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；用雙氧水溶液滴加于切片上，在37℃的濕盒孵育10 min左右，以消除過氧化物酶；用高壓鍋在120℃保壓2 min，充分暴露抗原；每張切片滴加Abcam公司的H3K79me2一抗（1:400稀釋）100 μL，置入4℃濕盒中過夜；滴加山羊抗兔二抗在37℃恒溫孵育20 min；滴加DAB顯色3 min，自來水沖洗5 min，再用蘇木紫復(fù)染并脫水；中性樹脂封固切片，顯微鏡下觀察并拍照；H3K79me2染色表達(dá)定位于細(xì)胞核，可呈淺黃色、棕黃色或深棕色。

1.4 結(jié)果判斷方法及數(shù)據(jù)分析

由2位病理科醫(yī)師讀片，對免疫組化染色進(jìn)行評分，評分要求在高倍鏡下隨機(jī)觀察，每個視野至少計(jì)數(shù)100個完整的腫瘤細(xì)胞，至少觀察5個視野。結(jié)果判定：（1）染色強(qiáng)度評分：淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，深棕色計(jì)3分。（2）陽性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比評分：陽性染色的細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比≤1%計(jì)0分，1%＜且≤25%計(jì)1分，25%＜且≤50%計(jì)2分，50%＜且≤75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。（3）染色總評分=染色強(qiáng)度評分×陽性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比評分，最低0分，最高12分。分析結(jié)直腸癌組織中H3K79me2的表達(dá)和癌旁正常組織中表達(dá)的差異；分析結(jié)直腸癌組織中H3K79me2表達(dá)和臨床特征之間的關(guān)系；分析H3K79me2表達(dá)和外周血CEA水平之間的相關(guān)性；研究H3K79me2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，并通過Cox回歸分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件，制圖使用Gragh Pad 8.0軟件。計(jì)量資料以M（QL，QU）表示，組間比較行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（n）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析；采用Spearman相關(guān)分析對兩組進(jìn)行相關(guān)性分析；生存分析通過繪制Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank法進(jìn)行計(jì)算。預(yù)后的多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型計(jì)算。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 隨訪

術(shù)后隨訪主要采用電話隨訪及門診隨訪方式，總體生存時間為手術(shù)日期至末次隨訪日期或因結(jié)直腸癌死亡的日期，該組病例無失訪、其它原因死亡等截尾數(shù)據(jù)。末次隨訪時間2019年8月31日，死亡病例25例，存活時間31.0（14.5，52.5）個月，生存病例53例，生存時間65.0（61.5，72.0）個月。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中H3K79me2表達(dá)的比較

結(jié)直腸癌組織中H3K79me2免疫組化陽性染色位于細(xì)胞核，為淺黃色至深棕色，見圖1。結(jié)直腸癌組織中H3K79me2表達(dá)評分為3（3，4）分，癌旁正常組織中評分為1（0，2）分。H3K79me2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-5.612，P＜0.01）。見圖2。

圖1 H3K79me在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的免疫組化染色

2.2 H3K79me2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

根據(jù)H3K79me2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的中位水平，將研究對象分為低表達(dá)組（44例）和高表達(dá)組（34例）。兩組年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、有無脈管侵犯及M分期比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而 H3K79me2高表達(dá)組中 T3～T4期患者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者及Ⅲ～Ⅳ期的患者占比高于低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。繼續(xù)采用Logistic回歸多因素分析，以H3K79me2表達(dá)為因變量（0=“低表達(dá)”、1=“高表達(dá)”），以T分期（0=“T1～T2期”、1=“T3～T4期”），N分期（0=“無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移”、1=“有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移”），TNM分期（0=“Ⅰ～Ⅱ期”、1=“Ⅲ～Ⅳ期”）為協(xié)變量，結(jié)果表明以T1～T2期為參照，T3～T4期是H3K79me2高表達(dá)的危險(xiǎn)因素；以無淋巴轉(zhuǎn)移為參照，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是H3K79me2高表達(dá)的危險(xiǎn)因素。因此，T3～T4期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是H3K79me2在結(jié)直腸癌中表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表2。

圖2 H3K79me2在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達(dá)

表1 H3K79me2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 n

表1（續(xù)）

表2 結(jié)直腸癌組織中H3K79me2的表達(dá)和臨床病理特征的多因素分析

2.3 結(jié)直腸癌組織中H3K79me2的表達(dá)與外周血CEA水平的相關(guān)性分析

本組78例患者血清癌胚抗原（CEA）檢驗(yàn)值5.0（2.4，16.9）ng/mL，結(jié)直腸癌組織中H3K79me2評分為3（3，4）分。采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果提示H3K79me2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與外周血CEA水平呈正相關(guān)（r=0.474，P＜0.01）。

2.4 結(jié)直腸癌組織中H3K79me2的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

該組78例結(jié)直腸癌患者，截至2019年8月生存率為68.0%（53/78），H3K79me2低表達(dá)組患者生存率為81.8%（36/44），高于高表達(dá)組的50.0%（17/34），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=10.880，P=0.010）。繪制Kaplan-Meier生存曲線（圖3），提示結(jié)直腸癌組織中H3K79me2高表達(dá)組患者生存率低于低表達(dá)組，且外周血CEA升高組患者生存率也低于正常組（均P＜0.05）。

圖3 結(jié)直腸癌中H3K79me2表達(dá)及CEA水平和預(yù)后的關(guān)系

2.5 結(jié)直腸癌中H3K79me2的表達(dá)與預(yù)后的多因素分析

先采用Cox回歸進(jìn)行單因素生存分析，顯示H3K79me2表達(dá)、CEA水平、T分期與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），雖然分化程度、N分期與預(yù)后未顯示相關(guān)性，但根據(jù)臨床實(shí)際與預(yù)后相關(guān)，且P值在0.05～0.10，兩者也納入多因素分析中，結(jié)果顯示H3K79me2表達(dá)（HR=3.007，P=0.017）和CEA水平（HR=3.165，P=0.017）是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。見表3。

表3 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的單因素和多因素預(yù)后分析

3 討論

近年來，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈顯著上升趨勢[10-12]。結(jié)直腸癌的發(fā)病因素和機(jī)制較為復(fù)雜，進(jìn)展期結(jié)直腸癌綜合治療的預(yù)后仍然不令人滿意[13]。因此，大量研究均旨在尋找早期特異性標(biāo)志物及新型治療靶點(diǎn)并制定個體化診療方案。表觀遺傳機(jī)制在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用逐漸被人重視。組蛋白修飾是表觀遺傳機(jī)制的重要內(nèi)容，與白血病及多種其他實(shí)體腫瘤密切相關(guān)[14-17]。異常的組蛋白修飾與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系十分密切，并且有助于腫瘤的轉(zhuǎn)移[18]。組蛋白修飾的形式仍未被完全闡明，主要包括甲基化、磷酸化、乙?；?、泛素化等[19]。組蛋白八聚體的H3和H4基團(tuán)是被化學(xué)修飾的主要基團(tuán)，通常發(fā)生在具有不穩(wěn)定性的N’末端精氨酸和賴氨酸殘基上，賴氨酸甲基化是最穩(wěn)定的組蛋白標(biāo)記。但組蛋白H3基團(tuán)79號賴氨酸（H3K79）位于組蛋白核心球狀結(jié)構(gòu)域上，而非位于N’末端，最早對啤酒酵母研究時發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)催化H3K79甲基化唯一的酶是DOT1[20]，人類及哺乳動物的同源酶DOT1-like蛋白，稱為DOT1L。目前研究發(fā)現(xiàn)DOT1L通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和H3K79甲基化來影響細(xì)胞的增殖，DOT1L高表達(dá)和胃癌的臨床特征及預(yù)后密切相關(guān)[21-22]。在彌漫性胃癌在人群中的遺傳易感性的研究中 發(fā) 現(xiàn) ， DOT1L、 PRSS1、 CTNNA1、 FBXO24、MAP3K6、INSR和MSR1等基因的突變可以明顯增加胃癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[23]。另有研究報(bào)道DOT1L、INSR及FBXO24的突變是新發(fā)現(xiàn)的彌漫性胃癌易感基因位點(diǎn)[24]。近年來對結(jié)直腸癌組織中DOT1L及H3K79的甲基化狀態(tài)的研究也逐漸增多，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)抑制DOT1L能影響結(jié)腸細(xì)胞增殖，也會導(dǎo)致細(xì)胞周期在S期停止，并可降低CDK2和Cyclin A2的表達(dá)，在DOT1L敲除后，可降低H3K79的甲基化水平[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)DOT1L可以誘導(dǎo)干細(xì)胞基因SOX2、NANOG、Pou5F1等的高表達(dá)，從而增加了發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，并發(fā)現(xiàn)DOT1L和H3K79me2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較高，DOT1L高表達(dá)組生存預(yù)期差，并且兩者表達(dá)量具有高相關(guān)性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)H3K79me2高表達(dá)組患者的存活率也較低[25]，其預(yù)示著H3K79me2可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等多個進(jìn)程密切相關(guān)。

在本研究中，我們通過免疫組化方法對本組結(jié)直腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行染色，再通過科學(xué)評分及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，提示結(jié)直腸癌組織中H3K79me2的表達(dá)高于癌旁正常組織，H3K79me2表達(dá)水平與T分期、N分期、TNM分期相關(guān)，且T分期和N分期是H3K79me2高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示H3K79me2表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。外周血CEA水平是評估結(jié)直腸癌疾病進(jìn)展、預(yù)測復(fù)發(fā)及預(yù)后的重要腫瘤標(biāo)記物，通過Spearman相關(guān)分析，表明H3K79me2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與CEA水平呈正相關(guān)，說明H3K79me2的表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)。我們進(jìn)一步通過繪制Kaplan-Meier生存曲線，顯示在結(jié)直腸癌組織中H3K79me2高表達(dá)組的生存率低于低表達(dá)組，且外周血CEA升高組患者生存率也低于正常組。進(jìn)一步Cox回歸分析，提示H3K79me2表達(dá)、CEA水平是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。研究結(jié)果有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來完善，此外，我們將進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌組織中調(diào)控H3K79me2的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L的表達(dá)情況，深入探討聯(lián)合檢測是否有助于結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估。

綜上所述，H3K79me2的表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，有望作為潛在的病情及預(yù)后判斷的檢測指標(biāo)，臨床上期待聯(lián)合CEA等其他腫瘤指標(biāo)物的檢測體現(xiàn)出更好的預(yù)測價(jià)值，并為結(jié)直腸癌的生物治療提供新的可能靶點(diǎn)。