一測多評法測定代代花中4 種二氫黃酮類成分

承 晨，顧崢嶸

常州市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，常州213000

代代花為蕓香科植物代代Citrus aurantium L.var.amara Engl.的干燥花蕾，又名枳殼花、酸橙花、香橙花，始載于《開寶本草》。主產于江蘇、浙江等省。味苦、酸，歸肝、胃經，具有行氣寬中、消食、化痰的功能[1-3]。代代花中含有豐富的揮發(fā)油、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等二氫黃酮類成分及N-甲基酪胺、辛弗林等生物堿類物質，并且黃酮類成分含量高于同科其他植物[4-6]。臨床上二氫黃酮類成分如橙皮苷，由于其具有維持血管正常滲透壓、降低血管脆性、縮短出血時間以及抗炎、抗病毒、預防凍傷等作用，被廣泛應用于心血管疾病的輔助治療。

一測多評法是利用中藥中有效成分內在函數(shù)關系和比例關系，通過測定一個成分（性質穩(wěn)定且易得到的對照品）而實現(xiàn)多個成分的同步測定。該方法能節(jié)約對照品，減少操作步驟[7-9]。代代花中柚皮苷對照品性質穩(wěn)定、價格便宜且易得，而新橙皮苷、蕓香柚皮苷價格昂貴。因此，本實驗采用HPLC法同時測定了代代花中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量，并采用一測多評的方法，根據(jù)上述4 種二氫黃酮類成分之間的函數(shù)關系和比例關系，以柚皮苷為內標物質，得到了柚皮苷與蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷之間的相對校正因子（f），計算出這3 種二氫黃酮類成分的量，為代代花多指標定量測定與質量控制提供了全新的分析模式。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（Agilent 有限公司）；LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters e2695 高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；3種色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm），島津Inertsil ODS-SP（4.6×250 mm，5 μm），Thermo Syncronis C18（4.6×250 mm，5 μm）；XP105DR 十萬分之一電子天平（美國Mettler 公司）。

1.2 藥品與試劑

對照品：柚皮苷（批號110722-201714，純度93.4%），橙皮苷（批號110721-201617，純度96.1%），新橙皮苷（批號111875-201703，純度99.3%）均購于中國食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷（批號B21364，純度≥98%）購于上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純（Merck 公司）；冰醋酸（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水。

6 批代代花購于多個中藥市場，批號分別定為：150629、141201、20130313、151014、20140410、150325，均經專家鑒定確認。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：0.4%磷酸-乙腈（84∶16）；檢測波長：283 nm；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品適量，用50%甲醇制成混合對照品儲備溶液（蕓香柚皮苷0.05921mg·mL-1、柚皮苷1.074 10 mg·mL-1、橙皮苷0.10273mg·mL-1、新橙皮苷3.02666mg·mL-1）。精密吸取混合對照品儲備溶液5 mL 至50 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取代代花樣品粉末，過篩（40 目）取0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱重，加熱回流1 h，放冷，加入50%甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗 取混合對照品、供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果見圖1。

由圖1 可見，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且均可通過DAD 純度檢測。各組分的理論塔板數(shù)均大于120 00，方法專屬性良好。

2.4.2 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下混合對照品儲備溶液5、2、1、0.5、0.2、0.1 mL 于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋配制成系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標（Y），對照品進樣量（μg）為橫坐標（X）繪制標準曲線，并進行線性回歸，結果見表1。

2.4.3 進樣精密度試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液（蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷濃度分別為5.921、107.410、10.273、302.66 μg·mL-1），按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，重復測定6 次，記錄峰面積。結果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品的峰面積的RSD 分別為0.18%、0.08%、0.13%、0.09%。表明儀器精密度良好。

表1 4 種化學成分的線性關系考察結果

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.3”項下供試品溶液（批號：151014）分別于配制后0、8、16、24、36、48 h 測定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面積，進樣量為10 μL。結果4 種成分峰面積的RSD 分別為0.71%、0.50%、0.45%、0.36%。表明供試品溶液在48 h 內具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.5 重復性試驗 取同一批次樣品（批號：151014）6 份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，以外標法進行計算，測得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量（g/g）RSD 分別為1.10%、0.85%、0.81%、0.80%。表明方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的代代花（批號：151014）50 mg，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6 份；精密加入蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷濃度分別為4.934、53.70、10.27、151.3 μg·mL-1的混合對照品溶液25 mL 及50%甲醇25 mL，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，計算加樣回收率。結果表明，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率分別為96.89%、99.91%、97.09%、98.34%；RSD 分別為1.39%、1.15%、1.07%、1.18%。表明該方法的準確度良好。

2.5 相對校正因子f 的計算

2.5.1 待測成分f 的測定 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液（蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷濃度分別為5.921、107.410、10.273、302.66 μg·mL-1），分別進樣1、2、4、6、8、10 μL，根據(jù)公式計算f。

fk/m=fk/fm=（Wm×Ak）/（Wk×Am）

Ak為內標物峰面積，Wk為內標物質量，Am為其他組分m 峰面積，Wm為其他組分m 質量。

以柚皮苷為內標物計算其它3 種成分的相對校正因子f，結果見表2。

2.5.2 不同儀器與色譜柱對f 的影響 考察了Agilent 1200、島津LC-20A、Waters e2695 型3 種高效液相色譜系統(tǒng)和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、島津Inertsil ODS-SP、Thermo Syncronis C183 種色譜柱。實驗表明，各種條件下所得的RSD＜1.5%，f 在不同的高效液相色譜儀與不同品牌色譜柱間具有良好的適應性。見表3。

表2 以柚皮苷為內標物的3 種成分的相對校正因子

表3 不同儀器與色譜柱對相對校正因子的影響

2.5.3 不同體積流量對f 的影響 考察了體積流量為0.8、1.0、1.2 mL·min-1時對f 的影響，結果見表4。

表4 不同體積流量對相對校正因子的影響

2.5.4 不同柱溫對f 的影響 考察了柱溫為20、30、40 ℃時對f 的影響，結果見表5。

2.6 待測色譜峰的定位

在“2.1”項確定的色譜條件下，吸取“2.2”項下混合對照品溶液，進樣量為10 μL，測定內標物質柚皮苷的相對保留值[rm/k=tR（m）/tR（k）]，根據(jù)rm/k即可正確判斷目標峰蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰位置。本研究測定了相對保留值在不同品牌儀器、不同色譜柱時的重現(xiàn)性，結果表明，各待測成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，均可通過DAD 純度檢測，且相對保留值RSD 均小于5%，可用于待測成分色譜峰的定位。見表6。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響

表6 不同儀器與色譜柱測得的相對保留時間

2.7 樣品含量測定

按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，進樣量為10 μL，采用外標法對代代花中4 種化學成分進行含量測定，同時與一測多評法計算的結果作比較，兩種方法所得結果無顯著性差異。見表7。

表7 一測多評法與外標法測得有效成分量的比較（g·g-1，%）

3 討論

3.1 因為柚皮苷價格低廉、性質穩(wěn)定，故本實驗選擇柚皮苷為內標物進行一測多評分析。本實驗通過對水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等溶劑的考察，發(fā)現(xiàn)使用50%的甲醇作為溶劑，樣品的提取效率高，在對照品色譜圖中，色譜峰峰形對稱，理論塔板數(shù)高，分離效果好。通過考察超聲、回流等不同提取方法以及提取時間選擇，發(fā)現(xiàn)加入50%甲醇50 mL，加熱回流1 h，效果最佳、提取充分。

3.2 在對代代花有效成分檢測波長的選擇上，對蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷作全波長掃描，由于4 種成分均屬于二氫黃酮類，其紫外吸收峰相似，均在283 nm 左右有最大吸收，故選定該波長。

3.3 本實驗采用HPLC 外標法測定代代花中柚皮苷的含量，同時測定并且計算出蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的相對校正因子f，利用f 值計算得到了其含量，實現(xiàn)了代代花的一測多評。同時，采用外標法計算代代花中蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的量，比較后發(fā)現(xiàn)外標法計算值與f 計算值之間沒有顯著性差異。

3.4 一測多評法是利用一種相對易得、廉價的內參物對照品，實現(xiàn)對多個成分的同時測定，最終達到控制中藥整體質量的目的[7]。本實驗只考察了一測多評法在同類成分間測定的可行性，其在不同類型化合物間定量測定的可行性仍需進一步研究。

3.5 代代花資源豐富，民間用其治療胸腹?jié)M悶脹痛、胃部下垂、脫肛及婦科疾病，應用前景十分廣闊。本研究利用一測多評法對代代花中的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷進行含量測定，具有較高的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及可靠度，從而豐富了代代花的質量評價方法，為研究提供了新思路，有利于代代花的質量控制。