LC-MS/MS測(cè)定單抗藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的樣品前處理方法研究進(jìn)展

王晴，孫吉葉，沙春潔，劉萬(wàn)卉*

（1.煙臺(tái)大學(xué)，山東 煙臺(tái) 264003；2.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺(tái) 264003）

LC-MS/MS測(cè)定單抗藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的樣品前處理方法研究進(jìn)展

王晴1，孫吉葉2，沙春潔2，劉萬(wàn)卉1*

（1.煙臺(tái)大學(xué)，山東 煙臺(tái) 264003；2.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺(tái) 264003）

隨著生物技術(shù)藥物研發(fā)的大力開(kāi)展，單抗類(lèi)藥物的藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)越來(lái)越受到重視。對(duì)近年來(lái)應(yīng)用LC-MS/MS檢測(cè)單抗類(lèi)藥物藥動(dòng)學(xué)特征的文獻(xiàn)進(jìn)行歸納，總結(jié)其樣品前處理的不同方法及各自優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，為單抗類(lèi)藥物L(fēng)C-MS/MS檢測(cè)方法的進(jìn)一步研究提供參考。

LC-MS/MS；抗體藥物；藥動(dòng)學(xué)參數(shù)；樣品前處理方法

自1986年首個(gè)治療性的單克隆抗體被美國(guó)FDA批準(zhǔn)以來(lái)，抗體藥物以其親和性高、活性高、副作用小、目標(biāo)性強(qiáng)、藥物-藥物相互作用小等特點(diǎn)迅速席卷藥品市場(chǎng)。尤其在炎癥或免疫疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、阿爾茨海默病、心血管疾病和傳染病等疾病的治療方面[1]，抗體藥物不斷創(chuàng)新。隨之，抗體藥物的臨床前藥動(dòng)學(xué)研究日益受到研究者的重視，在分析技術(shù)方面也迫切需要開(kāi)發(fā)更為準(zhǔn)確、靈敏、特異性強(qiáng)的方法。

目前用于抗體藥物臨床前藥動(dòng)學(xué)（PK）特征檢測(cè)的方法，主要有ELISA法和LC-MS/MS方法。ELISA法應(yīng)用普遍，直接、快速，可用于高通量檢測(cè)，但其具有一些局限性，如檢測(cè)范圍較窄（2個(gè)數(shù)量級(jí)）[2]、尋找特異的抗原或抗體較復(fù)雜、只能測(cè)定游離的抗原或抗體含量[1]。LC-MS/MS作為一種新方法，彌補(bǔ)了ELISA法的眾多缺點(diǎn)，其有較寬的分析范圍（2～5個(gè)數(shù)量級(jí)）、較好的精密度（CV%≤15%）、分析靈敏度高[定量下限（LLOQ）可達(dá)1 μg·L-1]、可進(jìn)行多參數(shù)檢測(cè)，與穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)和適當(dāng)?shù)目贵w富集處理過(guò)程相結(jié)合，該方法目前已應(yīng)用于多肽類(lèi)[3]、生物標(biāo)記物[4]、抗藥抗體（ADA）[5-6]、抗體藥物聯(lián)合體（ADC）[7]和抗體藥物（利妥昔單抗[8]、Prolia[9]等）的PK特征研究。

LC-MS/MS方法測(cè)定單抗PK參數(shù)的難點(diǎn)在于樣品前處理，因?yàn)閱慰故窍鄬?duì)分子質(zhì)量約為150 000的蛋白質(zhì)，且內(nèi)源性血漿干擾蛋白含量高達(dá)60～80 g·L-1[10]，故一般的用于化藥樣品的前處理方法不適用于單抗藥物。本文綜述了近年來(lái)LC-MS/MS方法測(cè)定單抗藥物PK參數(shù)的樣品前處理方法，為血清單抗測(cè)定的樣品前處理方法的選擇提供參考信息，為確定藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)中合理給藥劑量、毒理實(shí)驗(yàn)中給藥范圍、藥物生理作用及代謝過(guò)程提供依據(jù)。

1 直接酶解法

直接酶解法即采用一定濃度的胰蛋白酶直接酶解含待測(cè)蛋白藥物的血清[3,11-15]。其中胰蛋白酶與待測(cè)蛋白的比例在1∶20到1∶100之間，常溫酶解需8～16 h[10]。該方法可分為2種處理方法：溶液中酶解和蛋白球酶解。

溶液中酶解：將蛋白藥物變性處理，在一定濃度的蛋白藥物溶液中加入還原劑二硫代蘇糖醇（DTT）溶液孵育，打開(kāi)折疊蛋白中的二硫鍵，然后加入烷基化試劑碘乙酰胺（IAA）使還原后的巰基烷基化，形成穩(wěn)定的硫化物，從而阻止二硫鍵的還原，使蛋白藥物徹底變性。按比例加入適量胰蛋白酶或胞內(nèi)蛋白酶溶液，使變性的蛋白藥物充分酶解，產(chǎn)生長(zhǎng)度大小不等的多肽片段。

蛋白球酶解：向含有待測(cè)蛋白藥物的血清[11-14]或組織研磨液[15]中加入甲醇、乙腈或甲酸等蛋白沉淀劑。血清中變性的蛋白經(jīng)離心形成蛋白球，取出蛋白球，使其在碳酸氫銨緩沖溶液中重新懸浮，加入一定濃度的胰蛋白酶，孵育酶解；或在重懸浮的碳酸氫銨緩沖溶液中加入DTT孵育后，再加入IAA進(jìn)一步變性處理，最后加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，使酶解更加完全[11]，得到多肽片段。通過(guò)LC-MS/MS選取合適的多肽片段并進(jìn)行定量，從而反映生物樣品中蛋白藥物濃度[15]。該方法簡(jiǎn)便、易于操作，但其干擾較大，該方法目前報(bào)道的最低LLOQ為0.1 mg·L-1[13]，一般LLOQ為2～5 mg·L-1。其中蛋白球酶解較溶液中酶解更有優(yōu)勢(shì)，可直接除去血清中可溶性蛋白、鹽類(lèi)和大量磷脂[16]。

文獻(xiàn)[12]比較了溶液中酶解和蛋白球酶解這2種方法的差異，其中蛋白球酶解的基質(zhì)效應(yīng)為79%，而溶液中酶解的基質(zhì)效應(yīng)為59%；蛋白球酶解的回收率為88%，而溶液中酶解的回收率僅為6%。此外，蛋白球酶解效率更高，酶解時(shí)間更短?？梢?jiàn)，蛋白球酶解優(yōu)于溶液中酶解。蛋白球酶解法越來(lái)越多地應(yīng)用于蛋白類(lèi)藥物，尤其是單抗藥物的PK研究。

2 酶解結(jié)合固相萃取法

酶解結(jié)合固相萃?。⊿PE）法即在直接酶解（溶液中酶解或蛋白球酶解）的基礎(chǔ)上結(jié)合了SPE[1]。常用的SPE小柱為Oasis MCX 96-well plate[16-17]，酶解后的混合溶液上樣至RP-SPE小柱中，可除去溶液中鹽類(lèi)和高水溶性雜質(zhì)，Oasis MCX 96-well plate主要用于除去胰蛋白酶酶解形成的雜質(zhì)多肽片段。

酶解結(jié)合SPE法可除去樣品中絕大多數(shù)干擾雜質(zhì)，純化生物樣品，使雜質(zhì)信號(hào)降低，LLOQ達(dá)到更低水平。應(yīng)用2D-SPE進(jìn)一步凈化酶解混合液后，可提高生物樣品中單抗檢測(cè)靈敏度至500 μg·L-1（或3 mmol·L-1）[16]。然而，經(jīng)過(guò)1D-或2D-SPE純化后，生物樣品中干擾蛋白濃度仍然很高，存在基質(zhì)效應(yīng)和靈敏度低等問(wèn)題，需進(jìn)一步研究以改善方法[16]。

3 白蛋白消耗法

白蛋白占全血中蛋白含量50%以上，約為45 g·L-1[20]，應(yīng)用白蛋白消耗試劑盒除去血清中大量的白蛋白或除去血清中其他雜質(zhì)蛋白質(zhì)，以富集含量較低的待測(cè)蛋白或單抗。市售白蛋白消耗試劑盒有消耗白蛋白、消耗IgG等種類(lèi)。一般經(jīng)白蛋白消耗試劑盒處理與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）可將混合蛋白溶液很好地分離[4,21]，得到目標(biāo)條帶。將目標(biāo)條帶取下，切碎加入胰蛋白酶孵育，使目標(biāo)蛋白酶解成多肽片段，進(jìn)行洗脫收集。該方法常用于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物標(biāo)記物的定量檢測(cè)[20]，一般蛋白試劑盒可除去血清樣品中50%的雜質(zhì)蛋白[10]。

白蛋白消耗試劑盒可檢測(cè)生物樣品中異常的生物標(biāo)志物[20]，依此判斷生理、病理進(jìn)程。白蛋白消耗試劑盒富集抗體藥物時(shí)，線性范圍為2～1 000 mg·L-1[21]。當(dāng)目標(biāo)蛋白有多種干擾蛋白時(shí)，如要除去生物樣品中多種干擾，需要針對(duì)特定蛋白應(yīng)用特定蛋白消耗試劑盒，因此需將蛋白試劑盒串聯(lián)使用。

4 蛋白A、G富集法

蛋白A、G是分別來(lái)自于金黃色葡萄球菌和鏈球菌G族的蛋白，可以與IgG的Fc區(qū)域特異性結(jié)合，同時(shí)蛋白A、G可以偶聯(lián)到磁珠上形成蛋白A、G磁珠復(fù)合體，或作為親和配基偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上，從而特異性地與樣品中的抗體分子結(jié)合，具有極高的選擇性，親和色譜所得蛋白的純度一步可達(dá)到95%以上。以結(jié)合了蛋白A、G的磁珠或瓊脂糖凝膠為載體，可富集血清中IgG，從而具備富集血清中抗體的能力。

利用蛋白A-凝膠富集血清中待測(cè)單抗，富集后溶

液以胞內(nèi)蛋白酶酶解，從而得到特征性片段，然后采用LC-MS/MS法檢測(cè)，其結(jié)果與ELISA法所得結(jié)果相吻合，在1～300 mg·L-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好[22]。大部分文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用蛋白G-磁珠進(jìn)行單抗或ADA的富集[5-6]，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。運(yùn)用蛋白G-磁珠富集法處理樣品，檢測(cè)給藥后猴血清中總單抗含量的線性范圍為0.781～50.5 mg·L-1；利用免疫富集法處理樣品，檢測(cè)猴血清中游離單抗含量的線性范圍為7.03～450 μg·L-1，由此可見(jiàn)，血清中總單抗和游離單抗含量相差很大[23]。蛋白A、G富集法優(yōu)于直接酶解法，可間接地將血清中待測(cè)單抗富集，用于單抗總含量的測(cè)定，但不能用于測(cè)定游離抗體含量[1]。

5 免疫法

特異型抗體、抗原或受體的特異性位點(diǎn)可與待測(cè)抗體Fab段發(fā)生特性結(jié)合，故可將其用于生物樣品中待測(cè)單抗的富集。一般實(shí)驗(yàn)步驟為：特異性捕獲劑結(jié)合到生物素化的磁珠上，加入生物樣品后，待測(cè)抗體Fab段即與捕獲劑相結(jié)合，形成磁珠-捕獲劑-待測(cè)抗體三聯(lián)復(fù)合物。應(yīng)用磁鐵與磁珠相吸的原理，除去雜質(zhì)，最后加入弱酸性溶液將抗體洗脫，再以胰蛋白酶酶解，得到目標(biāo)多肽，進(jìn)行液質(zhì)檢測(cè)[7-8,24-27]。

該方法因特異性捕獲蛋白不易制備[20]，且只能用于測(cè)定生物樣品中游離待測(cè)單抗[1]，故其應(yīng)用受到限制。但采用該方法處理樣品，檢測(cè)的靈敏度較高（LLOQ可達(dá)1 μg·L-1）。例如，文獻(xiàn)[25]報(bào)道利用免疫富集法捕獲生物樣品中利妥昔單抗，LLOQ可達(dá)到3.13 μg·L-1。在測(cè)定猴血清中單抗時(shí)，該方法靈敏度（LLOQ為7.03 μg·L-1）是蛋白G富集方法（LLOQ為0.78 mg·L-1）的100倍[23]；在測(cè)定類(lèi)胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子（IGF-1）時(shí)，該方法與直接酶解法相比靈敏度提高了250倍[1]。該方法檢測(cè)結(jié)果與ELISA法相近[7-8]。

6 抗人IgG Fc富集法

抗人IgG Fc抗體一般來(lái)自羊、鼠、猴等動(dòng)物，該單抗的Fab段可特異性地結(jié)合人IgG的Fc段?？谷薎gG Fc抗體作為捕獲劑，可特異性地捕獲動(dòng)物血清中含有人IgG Fc片段的抗體（人源化或嵌合型單抗）。將該捕獲劑與磁珠結(jié)合，除去雜質(zhì)，將待測(cè)單抗酶解，即可采用LC-MS/MS進(jìn)行定量分析[9,28-30]。

該方法為近幾年發(fā)展起來(lái)的LC-MS/MS測(cè)定單抗臨床前PK特征的常用樣品前處理方法，所用試劑易于獲得、價(jià)格便宜、易于操作、具有一定的通用性，因此該方法應(yīng)用越來(lái)越廣泛[9,28-30]。研究人員分別以蛋白球酶解法、蛋白A/G富集法、抗人IgG Fc富集法進(jìn)行樣品前處理，然后采用LC-MS/MS檢測(cè)猴血清中PCSK9單抗含量，結(jié)果顯示，應(yīng)用抗人IgG Fc抗體富集法進(jìn)行樣品前處理，檢測(cè)靈敏度最高（LLOQ為100 μg·L-1）。使用LC-MS/MS測(cè)得的給藥后猴血清中PCSK9單抗的含量略高于ELISA方法所得結(jié)果，經(jīng)抗人IgG Fc富集法前處理結(jié)合LC-MS/MS檢測(cè)可捕獲臨床前生物樣品中總的待測(cè)抗體。ELISA方法靈敏度較高，最低LLOQ為1.25 μg·L-1，但LC-MS/MS方法可以同時(shí)測(cè)定待測(cè)單抗和內(nèi)標(biāo)含量，使用內(nèi)標(biāo)對(duì)單抗進(jìn)行定量，結(jié)果更加準(zhǔn)確，可信度更高[29]。

7 結(jié)語(yǔ)

在單抗藥物的PK研究中，ELISA法是常規(guī)的檢測(cè)途徑，但對(duì)于機(jī)體產(chǎn)生抗藥抗體時(shí)ELISA方法具有一定的局限性。而在選擇適宜方法對(duì)血清樣品進(jìn)行前處理后，結(jié)合LC-MS/MS可檢測(cè)出生物樣品中待測(cè)單抗的確切含量——這是避免單抗藥物產(chǎn)生毒性并確定合理給藥劑量的前提。

以上LC-MS/MS方法檢測(cè)單抗PK特征的樣品前處理方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。直接酶解法雖然前處理步驟簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，但其靈敏度較低；酶解結(jié)合SPE，操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單同時(shí)提高了靈敏度，但用于監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期給藥的靈敏度仍不夠；白蛋白消耗試劑盒方法，步驟簡(jiǎn)便易于操作，但需結(jié)合SDS-PAGE等分離純化方法以提高靈敏度，該方法不易實(shí)現(xiàn)高通量，通常應(yīng)用于生物標(biāo)記物的檢測(cè)，較少應(yīng)用于單抗的樣品前處理；采用蛋白A、G富集法進(jìn)行樣品前處理，檢測(cè)的靈敏度與酶解結(jié)合SPE法相當(dāng)，但操作相對(duì)復(fù)雜；免疫富集法靈敏度最高，但其操作步驟繁瑣且試劑昂貴不易獲得；抗人IgG Fc抗體法是新興的一種富集方法，其靈敏度較高，試劑易于獲取，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但靈敏度較免疫富集法略低。表1對(duì)各種樣品前處理方法的靈敏度、

回收率和效率進(jìn)行了比較。在抗體藥物研發(fā)初期，對(duì)靈敏度要求不高時(shí)，可建立直接酶解法、酶解結(jié)合SPE法或蛋白A、G富集法對(duì)單抗血清樣品進(jìn)行樣品前處理，以進(jìn)行臨床前PK特征的監(jiān)測(cè)；在單抗藥物開(kāi)發(fā)后期，要求較高的靈敏度，則需要應(yīng)用免疫富集法或抗人IgG Fc抗體法結(jié)合LC-MS/MS監(jiān)測(cè)單抗藥物的PK特征。

表1 LC-MS/MS檢測(cè)單抗藥動(dòng)學(xué)特征的樣品前處理方法比較Table1 Comparison of several sample pretreatment methods for detecting monoclonal antibodies’ PK characteristics by LC-MS/MS

綜上所述，應(yīng)用LC-MS/MS方法評(píng)價(jià)單抗藥物PK特征時(shí)，樣品前處理是關(guān)鍵。選取恰當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒芍苯佑绊戩`敏度、準(zhǔn)確度與精密度等參數(shù)。在篩選過(guò)程中要依據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)中待測(cè)單抗?jié)舛确秶?，多方法?duì)比或聯(lián)合使用，選取適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒?，從而得到藥物在體內(nèi)準(zhǔn)確可靠的PK特性，為藥物給藥方案的設(shè)計(jì)以及PK評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

[1]Ezan E, Becher F.Critical comparison of MS and immunoassays for the bioanalysis of therapeutic antibodies [J].Bioanalysis, 2009, 1 (8): 1375-1388.

[2]Bronsema K J, Bischoff R, Merbel N C.High-sensitivity LC-MS/MS quantifcation of peptides and proteins in complex biological samples: the impact of enzymatic digestion and internal standard selection on method performance [J].Anal Chem, 2013, 85 (20): 9528-9535.

[3]Barnidge D R, Dratz E A, Martin T,et al.Absolute quantifcation of the G protein-coupled receptor rhodopsin by LC/MS/MS using proteolysis product peptides and synthetic peptide standards [J].Anal Chem, 2003, 75 (3): 445-451.

[4]Holewinski R J, Jin Z, Powell M J,et al.A fast and reproducible method for albumin isolation and depletion from serum and cerebrospinal fuid [J].Proteomics, 2013, 13 (5): 743-750.

[5]Heinig K, Wirz T, Schick E,et al.Bioanalysis of therapeutic peptides: differentiating between total and anti-drug antibody bound drug using liquid chromatography-tandem mass spectrometry quantitation [J].J Chromatogr A, 2013, 1316: 69-77.

[6]Wang S J, Wu S T, Gokemeijer J,et al.Attribution of the discrepancy between ELISA and LC-MS/MS assay results of a PEGylated scaffold protein in post-dose monkey plasma samples due to the presence of antidrug antibodies [J].Anal Bioanal Chem, 2012, 402 (3): 1229-1239.

[7]Hengel S M, Sanderson R, Valliere-Douglass J,et al.Measurement ofin vivodrug load distribution of cysteine-linked antibody-drug conjugates using microscale liquid chromatography mass spectrometry [J].Anal Chem, 2014, 86 (7): 3420-3425.

[8]Dubois M, Fenaille F, Clement G,et al.Immunopurifcation and mass spectrometric quantifcation of the active form of a chimeric therapeutic antibody in human serum [J].Anal Chem, 2008, 80 (5): 1737-1745.

[9]Onami I, Ayabe M, Murao N,et al.A versatile method for proteinbased antigen bioanalysis in non-clinical pharmacokinetics studies of a human monoclonal antibody drug by an immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].J Chromatogra A, 2014 (1334): 64-71.

[10]Li F, Fast D, Michael S.Absolute quantitation of protein therapeutics in biological matrices by enzymatic digestion and LC-MS [J].Bioanalysis,

2011, 3 (21): 2459-2480.

[11]Jiang H, Zeng J, Titsch C,et al.Fully validated LC-MS/MS assay for the simultaneous quantitation of coadministered therapeutic antibodies in cynomolgus monkey serum [J].Anal Chem, 2013 (85): 9859-9867.

[12]Ouyang Z, Furlong M T, Wu S,et al.Pellet digestion: a simple and effcient sample preparation technique for LC-MS/MS quantifcation of large therapeutic proteins in plasma [J].Bioanalysis, 2012, 4 (1): 17-28.

[13]Furlong M T, Ouyang Z, Wu S,et al.A universal surrogate peptide to enable LC-MS/MS bioanalysis of a diversity of human monoclonal antibody and human Fc-fusion protein drug candidates in pre-clinical animal studies [J].Biomed Chromatogr, 2012, 26 (8): 1024-1032.

[14]Nouri-Nigjeh E, Zhang M, Ji T,et al.Effects of calibration approaches on the accuracy for LC-MS targeted quantifcation of therapeutic protein [J].Anal Chem, 2014, 86 (7): 3575-3584.

[15]Duan X, Abuqayyas L, Dai L,et al.High-throughput method development for sensitive, accurate, and reproducible quantification of therapeutic monoclonal antibodies in tissues using orthogonal array optimization and nano liquid chromatography/selected reaction monitoring mass spectrometry [J].Anal Chem, 2012, 84 (10): 4373-4382.

[16]Yuan L, Aubry A F, Arnold M E,et al.Systematic investigation of orthogonal SPE sample preparation for the LC-MS/MS bioanalysis of a monoclonal antibody after pellet digestion [J].Bioanalysis, 2013, 5 (19): 2379-2391.

[17]Heudi O, Barteau S, Zimmer D,et al.Towards absolute quantifcation of therapeutic monoclonal antibody in serum by LC-MS/MS using isotopelabeled antibody standard and protein cleavage isotope dilution mass spectrometry [J].Anal Chem, 2008, 80 (11): 4200-4207.

[18]Bronsema K J, Bischoff R, Bouche M P,et al.High-sensitivity quantitation of a Nanobody?in plasma by single-cartridge multidimensional SPE and ultra-performance LC-MS/MS [J].Bioanalysis, 2015, 7 (1): 53-64.

[19]Yang Z, Ke J, Hayes M,et al.A sensitive and high-throughput LCMS/MS method for the quantifcation of pegylated-interferon-alpha2a in human serum using monolithic C18 solid phase extraction for enrichment [J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2009, 877 (18/19): 1737-1742.

[20]Baba M, Ohyama K, Kishikawa N,et al.Optimization of separation and digestion conditions in immune complexome analysis [J].Anal Biochem, 2013, 443 (2): 181-186.

[21]Hagman C, Ricke D, Ewert S,et al.Absolute quantification of monoclonal antibodies in biofluids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].Anal Chem, 2008, 80 (4): 1290-1296.

[22]Liu H, Manuilov A V, Chumsae C,et al.Quantitation of a recombinant monoclonal antibody in monkey serum by liquid chromatography-mass spectrometry [J].Anal Biochem, 2011, 414 (1): 147-153.

[23]Fernández Oca?a M, James I T, Kabir M,et al.Clinical pharmacokinetic assessment of an anti-MAdCAM monoclonal antibody therapeutic by LC-MS/MS [J].Anal Chem, 2012, 84 (14): 5959-5967.

[24]Jiang H, Xu W, Titsch C A,et al.Innovative use of LC-MS/MS for simultaneous quantitation of neutralizing antibody, residual drug, and human immunoglobulin G in immunogenicity assay development [J].Anal Chem, 2014, 86 (5): 2673-2680.

[25]Onami I, Ayabe M, Murao N,et al.A versatile method for protein-based antigen bioanalysis in non-clinical pharmacokinetics studies of a human monoclonal antibody drug by an immunoaffnity liquid chromatographytandem mass spectrometry [J].J Chromatogr A, 2014, 21 (1334): 64-71.

[26]Xu W, Jiang H, Titsch C,et al.Development and characterization of a pre-treatment procedure to eliminate human monoclonal antibody therapeutic drug and matrix interference in cell-based functional neutralizing antibody assays [J].J Immunol Methods, 2015, 416: 94-104.

[27]McAvoy T, Lassman M E, Spellman D S,et al.Quantification of tau in cerebrospinal fuid by immunoaffnity enrichment and tandem mass spectrometry [J].Clin Chem, 2014, 60 (4): 683-689.

[28]Li H, Ortiz R, Tran L,et al.General LC-MS/MS method approach to quantify therapeutic monoclonal antibodies using a common whole antibody internal standard with application to preclinical studies [J].Anal Chem, 2012, 84 (3): 1267-1273.

[29]Zhang Q, Spellman D S, Song Y,et al.Generic automated method for liquid chromatography-multiple reaction monitoring mass spectrometry based monoclonal antibody quantitation for preclinical pharmacokinetic studies [J].Anal Chem, 2014, 86 (17): 8776-8784.

[30]Law W S, Genin J C, Miess C,et al.Use of generic LC-MS/MS assays to characterize atypical PK profile of a biotherapeutic monoclonal antibody [J].Bioanalysis, 2014, 6 (23): 3225-3235.

Recent Progress in Sample Pretreatment Methods for Detecting Monoclonal Antibodies’ Pharmacokinetics Parameters by LC-MS/MS

WANG Qing1, SUN Jiye2, SHA Chunjie2, LIU Wanhui1
(1.Yan Tai University, Yantai 264003, China; 2, Shandong Luye Pharmaceutical Co., Ltd., Yantai 264003, China)

With the vigorous research and development of biopharmaceuticals, increased importance has been attached to the pharmacokinetic evaluation of therapeutic monoclonal antibodies (mAbs).Based on literature retrieval of recent articles on PK profle determination of therapeutic mAbs by LC-MS/MS, different methods for sample pretreatment, the advantages and disadvantages of each method as well as their respective application ranges were summarized in this paper, so as to provide

for further studies on determination of mAbs by LC-MS/MS.

LC-MS/MS; therapeutic antibody; PK parameter; method for sample pretreatment.

R917

A

1001-5094（2015）04-0300-05

接受日期：2015-02-03

*通訊作者：劉萬(wàn)卉，綠葉制藥集團(tuán)有限公司制劑與分析研究中心副總裁，科技部“長(zhǎng)效緩控釋及靶向技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”副主任，煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院副院長(zhǎng)；

研究方向：藥物代謝動(dòng)力學(xué)，長(zhǎng)效緩釋微球制劑的研究開(kāi)發(fā)；

Tel：0535-8308288；E-mail：wanhui@luye.cn