油菜BnTIP2;3的克隆及生物信息學(xué)分析

趙麗華，李甜飴，劉改霞，程興茹，李如冰，李文靜,2,3?

(1.廊坊師范學(xué)院，河北 廊坊 065000;2.河北省動(dòng)物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 廊坊 065000;3.廊坊市細(xì)胞工程與應(yīng)用研究重點(diǎn)驗(yàn)室，河北 廊坊065000;4.巴彥淖兒市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 巴彥淖兒 015000)

0 引言

水孔蛋白屬于古老的廣泛存在于所有生物里的主要膜內(nèi)在蛋白（major intrinsic protein，MIP）家族，在生物的物質(zhì)代謝中起著重要作用［1］。根據(jù)序列同源性和亞細(xì)胞定位的不同，水孔蛋白可以分為4 類，包括液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic protein，TIP）、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic protein，PIP）、NOD26-like內(nèi)在蛋白（NOD26-like intrinsic protein NIP）和小的內(nèi)在蛋白（small and basic intrinsic protein，SIP）［2-3］。后來人們又在苔蘚中發(fā)現(xiàn)了X 內(nèi)在蛋白（X intrinsic protein，XIPs），該蛋白僅在少量高等植物和大量低等植物中存在［4］。迄今為止，植物中水孔蛋白的研究主要集中在PIPs 上。甘藍(lán)型油菜屬于十字花科蕓薹屬雙子葉植物，目前對(duì)其研究大多集中于脂肪酸組成及代謝［5-10］以及蛋白參與植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)調(diào)控方面［11-15］，對(duì)于甘藍(lán)型油菜AQP（Aquaporin）水孔蛋白研究較少。

因此，本文利用生物信息學(xué)軟件對(duì)油菜BnTIP2;3蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為其生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜幼苗種于廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院培養(yǎng)室。選取健壯植株的葉片，用去離子水清洗表面，吸水紙吸干，然后用液氮速凍，-80℃保存，用于水孔蛋白基因克隆。

1.2 主要試劑

DNA marker、10×Loading Buffer、DNA 聚合酶、10×PCR Buffer、限制性內(nèi)切酶SacΙ、BamHΙ?？寺≥d體pTOPO-Blunt cloning kit、MiniBEST Plant RNA Extration Kit、PrimeScript ? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，均購于大連TaKaRa 公司。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株由廊坊師范學(xué)院植物遺傳實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 油菜總RNA提取及cDNA合成

根據(jù)MiniBEST Plant RNA Extration Kit 說明書提取油菜幼苗總RNA，取2 μL 于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測其完整性。以總RNA為模板，使用Prime-Script?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一條鏈，作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 油菜BnTIP2;3基因cDNA序列克隆

根據(jù)GeneBank 中收錄的BnTIP2;3基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1min，共30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后對(duì)目的片段進(jìn)行凝膠回收。取適量回收純化產(chǎn)物與pTOPO平末端載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans10。將陽性克隆送至上海美吉生物公司測序。

1.5 BnTIP2;3的生物信息學(xué)分析

對(duì)測定序列用ExPASy ProtParam，預(yù)測BnTIP2;3編碼氨基酸序列分子質(zhì)量、等電點(diǎn)疏水性；利用Signal P 3.0 Server 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測；利用TMHMM Server 2.0 進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)預(yù)測；利用NCBI 網(wǎng)站上的CDD 分析BnTIP2-3 蛋白保守域。利用YLoc 進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；利用SOPMA 和SWISS-MODEL軟件預(yù)測其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。將BnTIP2;3 蛋白全長序列提交到NCBI的BLASTP中獲得其同源序列，利用MEGA7 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，分支處的數(shù)字表示該分支分析的可靠程度，數(shù)值越大、可信度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1BnTIP2;3基因的克隆

根據(jù)油菜BnTIP2;3序列，從油菜幼苗中RTPCR 擴(kuò)增得到一條753 bp 的DNA 序列（圖1）。將PCR 產(chǎn)物與pTOPO-Blunt Cloning vector 進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增，得到一條與ORF 全長一致的片段。進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切獲得一條1865 bp pTOPO-Blunt Cloning vector 和一條753 bp 目的基因片（圖2）。綜上所述，BnTIP2;3編碼250個(gè)氨基酸，成功獲得重組質(zhì)粒pTOPO-BnTIP2;3。

2.2 BnTIP2;3的理化性質(zhì)分析

利用ExPASyProtParam 在線分析BnTIP2;3 蛋白的序列組成和理化性質(zhì)。BnTIP2;3 分子式為C1171H1834N282O327S5，相對(duì)分子量為25.25 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為4.84，該蛋白由20種250個(gè)氨基酸組成，含量最高的3種氨基酸分別是：甘氨酸（Gly）14.4%、丙氨酸（Ala）13.2%和纈氨酸（Val）12.0%?？偲骄杷?、脂肪族指數(shù)和不穩(wěn)定指數(shù)分別為0.970、122.88和22.00，表明該蛋白為穩(wěn)定性蛋白。

圖1BnTIP2;3基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 pTOPO-BnTIP2;3載體雙酶切鑒定圖

2.3 BnTIP2;3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測與分析

運(yùn)用TMHMM Server 2.0 軟件對(duì)BnTIP2;3 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測（圖3）。結(jié)果表明BnTIP2;3 含有6 個(gè)跨膜螺旋、屬于跨膜蛋白。亞細(xì)胞定位顯示該蛋白為分泌型蛋白，與跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致。

圖3 BnTIP2;3蛋白的跨膜螺旋區(qū)分析

2.4 BnTIP2;3蛋白信號(hào)肽預(yù)測

采用在線軟件SignalP 5.0 Server 對(duì)BnTIP2;3蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明BnTIP2;3序列中無明顯的信號(hào)肽序列。

圖4 BnTIP2;3蛋白軟件的信號(hào)肽分析

2.5 BnTIP2;3蛋白的親水性和疏水性預(yù)測

圖5 BnTIP2;3蛋白的親水性分析

采用ProtScale 軟件對(duì)BnTIP2;3 蛋白的親水/疏水性進(jìn)行預(yù)測（圖5）。通過對(duì)242 個(gè)氨基酸（5-246）綜合分析，發(fā)現(xiàn)204個(gè)氨基酸（84.29）分布在高分值區(qū)，總得分為264.177；而38個(gè)氨基酸分布在低分值區(qū)，總得分為-25.048。由此可見，BnTIP2;3蛋白存在大量疏水氨基酸殘基，為疏水性蛋白質(zhì)。

2.6 BnTIP2;3保守結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI的CDD對(duì)甘藍(lán)型油菜BnTIP2;3氨基酸的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析（圖6）。結(jié)果表明BnTIP2;3氨基酸序列中含有兩個(gè)NPA保守結(jié)構(gòu)域，屬于MIP超家族成員。

圖6 BnTIP2;3蛋白保守域分析

2.7 BnTIP2;3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

采用SOPMA 對(duì)BnTIP2;3 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白ɑ-螺旋（H）占35.6%，延伸鏈（E）占21.6%，β-轉(zhuǎn)角（T）占5.2%，無規(guī)卷曲（C）占37.6%。由此可見，BnTIP2;3 蛋白主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)則卷曲和ɑ-螺旋。

2.8 BnTIP2;3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)BnTIP2;3蛋白進(jìn)行同源建模，對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)5i32.1進(jìn)行建模，序列同源性為77.08%，全局模型質(zhì)量評(píng)估值為85%，說明該預(yù)測結(jié)果可靠（圖7），且與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

圖7 BnTIP2;3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.9 BnTIP2;3蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

將甘藍(lán)型油菜基因編碼的氨基酸BnTIP2;3 序列在GenBank 進(jìn)行Blastp 搜索，發(fā)現(xiàn)BnTIP2;3 與多種植物水孔蛋白具有較高的序列相似性。選取同源性較高的7 條序列，白菜型油菜（Brassica raoa、XP_009101423.1）、芥菜（Capsella rubella、XP_006284410.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana、NP_199556.1） 、亞麻芥（Camelina sativa、XP_010441462.1）、臺(tái)灣南芥（Arabis alpine、KFK_31373.1） 、 亞麻芥（Camelina sativa、 XP_010440021.1）、羽衣甘藍(lán)（Brassica oleraceavar.olera、XP_013605765.1）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建（圖8）。結(jié)果表明，來自8 個(gè)不同植物的TIP2-3 聚成2 個(gè)分支。BnTIP2;3 與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、亞麻芥（Camelina sativa）以及臺(tái)灣南芥（Arabis alpine）親緣關(guān)系較近，這與他們均隸屬十字花科植物的進(jìn)化及分類地位較一致。

圖8 不同植物TIP2;3蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

植物水孔蛋白主要包括定位于液泡的TIP蛋白和定位于質(zhì)膜的PIP 蛋白，其中TIPs 根據(jù)N 端和C端序列不同，基于系統(tǒng)進(jìn)化分析按照種類多少分為TIP2、TIP4、TIP1、TIP3和TIP5五個(gè)亞類。其TIP2和TIP1 兩種水通道蛋白在基因組中大量存在，而TIP5 在植物種類中罕見存在［16］。

本文首次以油菜BnTIP2;3蛋白為研究對(duì)象，通過基因克隆及各種生物信息學(xué)軟件對(duì)其理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)BnTIP2;3是一種由20種250個(gè)氨基酸組成、無信號(hào)肽、含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)。功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示BnTIP2;3具有PLN00168結(jié)構(gòu)域，屬于MIP超家族基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明BnTIP2;3 與擬南芥、亞麻芥、臺(tái)灣南芥親緣關(guān)系較近，與傳統(tǒng)分類地位一致。以上結(jié)果對(duì)于全面確立水通道蛋白在植物中的功能起到重要作用。

4 結(jié)論

采用一系列在線生物信息學(xué)軟件對(duì)油菜BnTIP2;3蛋白的理化性質(zhì)和各級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)BnTIP2;3 是由20 種250 個(gè)氨基酸組成，不含信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，具有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于穩(wěn)定的疏水蛋白質(zhì)；ɑ-螺旋和無規(guī)則卷曲是BnTIP2;3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成元件。該項(xiàng)工作的開展，為將來深入了解油菜BnTIP2;3基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。