動(dòng)態(tài)調(diào)控：一種高效的細(xì)胞工廠工程化代謝改造策略

葉健文 陳江楠 張旭 吳赴清 陳國(guó)強(qiáng)

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084）

代謝工程改造是構(gòu)建工業(yè)化細(xì)胞工廠的一種重要的合成生物學(xué)手段。微生物則是目前代謝工程改造的主要研究對(duì)象之一。其合成的豐富的代謝產(chǎn)物涵蓋了食品、醫(yī)療、燃料、高分子材料等應(yīng)用領(lǐng)域。目前，基于代謝工程改造構(gòu)建的微生物細(xì)胞工廠已被廣泛應(yīng)用到萜類化合物［1］、聚酮類化合物［2］、生物塑料制品［3］等高值產(chǎn)品的生產(chǎn)中。除此之外，工程化改造的微生物在活體功能材料、水土修復(fù)等眾多領(lǐng)域均具有較好的應(yīng)用潛力。因此，細(xì)胞工廠的工程化改造無(wú)論在高值產(chǎn)物合成還是在功能化微生物的改造中，都有著重要的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。然而，由于微生物自身復(fù)雜的代謝途徑和調(diào)控關(guān)系，給細(xì)胞工廠的理性改造帶來(lái)很多挑戰(zhàn)與不確定性。因此開(kāi)發(fā)高效的代謝工程改造方法，不僅可以有效地提升細(xì)胞工廠構(gòu)建的效率，而且還可以進(jìn)一步強(qiáng)化工程化細(xì)胞的工作效能。

隨著分子生物學(xué)、合成生物學(xué)［4-5］、基因組學(xué)和蛋白組學(xué)［6］等領(lǐng)域的快速發(fā)展，新的代謝工程改造技術(shù)也不斷被開(kāi)發(fā)、豐富，涵蓋了代謝通路構(gòu)建、表達(dá)，復(fù)雜且精細(xì)的通路調(diào)諧、調(diào)控，以及代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)分析等基于系統(tǒng)與合成生物學(xué)的新技術(shù)［7］。而靜態(tài)調(diào)控改造策略是目前研究最多、應(yīng)用最廣的細(xì)胞改造策略。近年來(lái)，隨著前沿生物技術(shù)的創(chuàng)新推動(dòng)和工業(yè)生物產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，動(dòng)態(tài)調(diào)控策略在代謝工程領(lǐng)域的作用和優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯出來(lái)［8-9］。因此，本文將重點(diǎn)綜述關(guān)于動(dòng)態(tài)調(diào)控的原理、特征，以及在代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用范例，同時(shí)總結(jié)了動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)設(shè)計(jì)與構(gòu)建的關(guān)鍵步驟及其在未來(lái)細(xì)胞工廠改造中的潛在應(yīng)用方式。

1 代謝工程中的調(diào)控方式

1.1 靜態(tài)調(diào)控

靜態(tài)調(diào)控是指通過(guò)設(shè)計(jì)和改造遺傳編碼組件對(duì)目標(biāo)代謝通路進(jìn)行靜態(tài)優(yōu)化的代謝工程改造策略［10］。這種改造方式的最大特征是定向、不可逆性，改造后的細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中不具備感應(yīng)指定信號(hào)而做出特定調(diào)整的能力。目前，靜態(tài)調(diào)控主要涵蓋了基因插入和敲除［11-12］，單/多基因的表達(dá)水平的調(diào)諧如啟動(dòng)子工程以調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平［13］、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（Ribosome binding site，RBS）改造以實(shí)現(xiàn)翻譯水平調(diào)節(jié)［14］，引入蛋白支架［15-16］，代謝流平衡分析［17］等方面（圖1-A）。

其中，敲除影響菌株目標(biāo)代謝物積累量的基因是構(gòu)建工程化菌株的重要手段之一，也是典型的靜態(tài)調(diào)控方式［18］。例如，Alper和 Stephanopoulos等［19］報(bào)道了一種基于全局化學(xué)計(jì)量學(xué)分析的單基因和多基因敲除的合理設(shè)計(jì)方法。該方法以大腸桿菌為出發(fā)菌，以番茄紅素為目標(biāo)產(chǎn)物，經(jīng)組合構(gòu)建了64個(gè)基因敲除突變株，篩選分析后番茄紅素的產(chǎn)量得到極大的提高。此外，通過(guò)構(gòu)建底盤(pán)菌的代謝網(wǎng)絡(luò)模型來(lái)進(jìn)行需敲除基因的預(yù)測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的高效合成［20］，是近年來(lái)基于系統(tǒng)與合成生物學(xué)開(kāi)發(fā)的一種更高效的方法。而且，隨著計(jì)算工具的進(jìn)一步發(fā)展，代謝網(wǎng)模型可用于預(yù)測(cè)基因敲除引起的全局基因表達(dá)水平的變化［21］，進(jìn)而可以系統(tǒng)地評(píng)估基因敲除對(duì)產(chǎn)物合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。該方法甚至還能用于計(jì)算上調(diào)、下調(diào)及微調(diào)目的基因表達(dá)水平后的代謝水平變化［22］，從而預(yù)測(cè)菌株改造的變異性，提高菌株改造的效率［23］。相關(guān)研究工作如提高琥珀酸、丁二醇等在大腸桿菌中的產(chǎn)量［24］及乙醇在酵母中產(chǎn)量［25］等是該研究領(lǐng)域的典型范例。

除基因敲除外，啟動(dòng)子工程和RBS改造也是靜態(tài)調(diào)控中較常用的方法。該方法可有效地調(diào)節(jié)代謝通路相關(guān)基因表達(dá)過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，從而控制通路中相關(guān)代謝物的合成或消耗速率。如通過(guò)基因簇表達(dá)量的調(diào)控，在谷氨酸棒桿菌（Cornyebacterium glutamicum）中實(shí)現(xiàn)賴氨酸的高產(chǎn)［26］。然而為了應(yīng)對(duì)更復(fù)雜的代謝通路表達(dá)量調(diào)諧，許多研究在不同的生物底盤(pán)中開(kāi)發(fā)了多種啟動(dòng)子和RBS庫(kù)，從而實(shí)現(xiàn)多基因表達(dá)調(diào)諧的高通量建庫(kù)篩選［13-14］。此外，Salis等［27］利用翻譯初始化的熱力學(xué)模型，通過(guò)減少具有抑制性的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的引入，從而實(shí)現(xiàn)RBS與核糖體結(jié)合能的預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)，從而理性設(shè)計(jì)和調(diào)控基因表達(dá)過(guò)程中的翻譯水平。

靜態(tài)調(diào)控因其易操作、周期短、效果顯著、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，在合成生物學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。以基于嗜鹽單胞菌合成聚（3-羥基丁酸-4羥基丁酸）P（3HB4HB）為例，首先實(shí)現(xiàn)4-羥基丁酸輔酶A（4HB-CoA）合成通路的構(gòu)建及驗(yàn)證，然后對(duì)相關(guān)的旁路基因進(jìn)行敲除，最后對(duì)4HB-CoA合成路徑的代謝通量進(jìn)行調(diào)諧，從而提高P34HB的產(chǎn)量（圖1-B）［11-12］。然而，在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，由于細(xì)胞代謝物或目標(biāo)代謝產(chǎn)物的組成和濃度會(huì)隨著培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成、生長(zhǎng)環(huán)境（主要是溶解氧濃度）以及細(xì)胞生長(zhǎng)速率的變化而發(fā)生改變，所以靜態(tài)調(diào)控所獲得的突變株無(wú)法感應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的代謝變化從而進(jìn)行自身的細(xì)胞活動(dòng)調(diào)節(jié)。因此，單一地減少或增加關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量可能會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不可逆的副作用，盡管突變菌株相對(duì)于出發(fā)菌株具有更高水平的產(chǎn)物積累能力，但受到細(xì)胞生長(zhǎng)率抑制、生長(zhǎng)魯棒性差、代謝紊亂等因素影響，使得目標(biāo)產(chǎn)物的合成未達(dá)到最優(yōu)化水平，且在后期放大生產(chǎn)過(guò)程中也可能面臨眾多挑戰(zhàn)［28-29］。

圖1 靜態(tài)調(diào)控概覽

1.2 動(dòng)態(tài)調(diào)控

由于目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率和產(chǎn)量往往受到細(xì)胞代謝失衡的限制難以被進(jìn)一步提升。因此，若只采用靜態(tài)調(diào)控，相關(guān)基因表達(dá)水平過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物合成的代謝流不足，而過(guò)高的表達(dá)量則不僅會(huì)導(dǎo)致較多冗余的mRNA、蛋白質(zhì)或中間產(chǎn)物積累，而且還可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用，如細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩或產(chǎn)生適應(yīng)性不良反應(yīng)，從而降低產(chǎn)量［10］。為了適時(shí)地平衡產(chǎn)物合成所需的基因表達(dá)與全局代謝水平之間的關(guān)系，動(dòng)態(tài)調(diào)控基因通路的引入能夠?qū)崟r(shí)響應(yīng)代謝信號(hào)，并及時(shí)進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，以便適應(yīng)宿主內(nèi)部代謝或環(huán)境的變化［30-32］，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定合成所需產(chǎn)物，提高發(fā)酵培養(yǎng)的穩(wěn)定性和可放大性。

通常，動(dòng)態(tài)調(diào)控是通過(guò)設(shè)計(jì)與構(gòu)建基因通路單元，使重組細(xì)胞可以動(dòng)態(tài)地感應(yīng)并處理特定信號(hào)，從而根據(jù)信號(hào)的改變進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)控，達(dá)到產(chǎn)物合成或目標(biāo)系統(tǒng)的最優(yōu)化狀態(tài)［33］。該系統(tǒng)中的特定信號(hào)可以是代謝通路中的中間產(chǎn)物、細(xì)胞系統(tǒng)的代謝物或蛋白等因子，也可以是外源引入合成的信號(hào)分子等。相比于靜態(tài)調(diào)控，動(dòng)態(tài)調(diào)控是一個(gè)以信號(hào)響應(yīng)為基礎(chǔ)的動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程，因此可以在線感知細(xì)胞狀態(tài)并進(jìn)行實(shí)時(shí)代謝調(diào)控［34］。該策略已經(jīng)在較多研究中得以應(yīng)用并實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的大幅度增產(chǎn)，如番茄紅素、脂肪酸、氨基酸、肌醇等高附加值生物合成制品［35-36］。

2 動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)

根據(jù)構(gòu)建原理或響應(yīng)機(jī)制不同，動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)可以分為代謝物依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控和非代謝物依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控；而根據(jù)其調(diào)控方式不同，又可以分為單向動(dòng)態(tài)調(diào)控和雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控。其中，代謝物依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控是以目標(biāo)通路的代謝產(chǎn)物以及因引入目標(biāo)通路而引起變化的內(nèi)源代謝物為響應(yīng)信號(hào)的調(diào)控方式。而非代謝物依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控是以外界環(huán)境因素或外源引入的與細(xì)胞系統(tǒng)正交的調(diào)控因子作為響應(yīng)信號(hào)的調(diào)控方式（圖2）。單向動(dòng)態(tài)調(diào)控是基于響應(yīng)信號(hào)對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)只進(jìn)行單一上調(diào)或下調(diào)調(diào)節(jié)［37］，而雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控則可以實(shí)現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)同時(shí)調(diào)節(jié)。表1中列出了近年來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)控用于代謝工程改造的典型應(yīng)用案例，包括了產(chǎn)物產(chǎn)量?jī)?yōu)化、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、嵌段大分子合成等。

圖2 動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)概覽

表1 動(dòng)態(tài)調(diào)控應(yīng)用于代謝工程改造的典型范例。

2.1 代謝物依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控

代謝物依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控通常是通過(guò)構(gòu)建生物傳感器感應(yīng)代謝物的濃度，從而該傳感器輸出信號(hào)可直接或間接調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)［44-45］。如番茄紅素的高效合成就是一個(gè)典型的研究案例。因?yàn)榇竽c桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中葡萄糖的過(guò)量供給會(huì)導(dǎo)致乙酸的積累，不僅抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而且削弱了番茄紅素合成通路的代謝流通量，從而降低番茄紅素在大腸桿菌中的產(chǎn)率。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸烯醇丙酮酸合成酶（Pps）是控制細(xì)胞內(nèi)甘油醛-3-磷酸酯和丙酮酸之間平衡的關(guān)鍵，而異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（Idi）是番茄紅素合成通路中的限速步驟。而在糖酵解通路中，乙酰磷酸是從丙酮酸生成乙酸的中間產(chǎn)物，因此構(gòu)建以乙酰磷酸分子為響應(yīng)信號(hào)的生物傳感器是實(shí)現(xiàn)番茄紅素合成通路動(dòng)態(tài)調(diào)控的關(guān)鍵。為此，研究者構(gòu)建響應(yīng)乙酰磷酸濃度的動(dòng)態(tài)調(diào)控開(kāi)關(guān)，在胞內(nèi)乙酰磷酸出現(xiàn)異常累積的情況下，上調(diào)磷酸烯醇丙酮酸合成酶（Pps）和異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（Idi）的表達(dá)水平，從而將丙酮酸逆向轉(zhuǎn)化成番茄紅素的上游合成前體磷酸烯醇丙酮酸，同時(shí)由于異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（Idi）的過(guò)表達(dá)，番茄紅素合成的關(guān)鍵酶表達(dá)量增加，增強(qiáng)了番茄紅素的代謝流通量，從而起到減少乙酸積累和增強(qiáng)番茄紅素合成的目的。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，基于動(dòng)態(tài)調(diào)控所獲得的番茄紅素滴定產(chǎn)量比簡(jiǎn)單的基因過(guò)表達(dá)方式所合成的產(chǎn)量提高18倍，同時(shí)產(chǎn)率也得到較顯著的提升［46］。

因此，此類動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的關(guān)鍵有兩點(diǎn)：一是找到與目標(biāo)代謝通路關(guān)聯(lián)且影響顯著的代謝物；二是構(gòu)建以該代謝物作為響應(yīng)信號(hào)的生物傳感器［47］。有趣的是，細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)通常天然存在各種各樣的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，用于調(diào)節(jié)自身的細(xì)胞活動(dòng)。因此，我們可以通過(guò)分子生物學(xué)和合成生物學(xué)手段對(duì)這種類型的生物傳感器進(jìn)行挖掘和二次開(kāi)發(fā)，變成實(shí)際代謝工程改造中所適用的動(dòng)態(tài)調(diào)控元件［48］。如研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成通路中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物脂肪酰輔酶A能與配體響應(yīng)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FadR蛋白結(jié)合，解除FadR蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的抑制作用［49］。因此，有研究者通過(guò)啟動(dòng)子工程改造獲得具有更嚴(yán)謹(jǐn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控性能的響應(yīng)開(kāi)關(guān)，建立基于脂肪酰輔酶A響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)生物柴油合成通路中各基因模塊的動(dòng)態(tài)調(diào)控，平衡目標(biāo)通路代謝物在胞內(nèi)的有效流通，減少宿主細(xì)胞的代謝壓力并提高生物柴油合成的穩(wěn)定性和滴定產(chǎn)量［50-51］。

這種基于天然調(diào)控因子改造而來(lái)的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，可以有效地拓寬動(dòng)態(tài)調(diào)控的應(yīng)用范圍，如拓展至其他代謝途徑的代謝物，可應(yīng)用于多種宿主進(jìn)行調(diào)控等。經(jīng)研究表明，大腸桿菌內(nèi)至少有36種此類配體響應(yīng)型轉(zhuǎn)錄因子可供開(kāi)發(fā)使用［50］。另外，來(lái)自其他生物體的配體響應(yīng)型轉(zhuǎn)錄因子也非常多。例如，氨基酸響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子［52-53］，葡萄糖［54］、乙酸［55-56］、磷酸根應(yīng)答型轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白等［57］。基于這些轉(zhuǎn)錄因子組成的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)可以用于宿主或異源宿主的代謝工程改造中，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝物合成關(guān)聯(lián)基因的動(dòng)態(tài)調(diào)控，從而提高產(chǎn)物產(chǎn)量和重組菌株的魯棒性。

2.2 非代謝物依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控

非代謝物依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控是通過(guò)感應(yīng)外界環(huán)境因素或與宿主細(xì)胞系統(tǒng)正交的信號(hào)分子而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)控。與代謝物依賴型動(dòng)態(tài)調(diào)控相比，該調(diào)控方式的要點(diǎn)在于不依賴目標(biāo)代謝通路，通用性強(qiáng)，但需重點(diǎn)評(píng)估外源信號(hào)引入對(duì)宿主代謝的影響。目前，該類型動(dòng)態(tài)調(diào)控大致包括群體感應(yīng)［58］、光控［41］、非編碼 RNA［39，59］、溫控［60］等（圖 2）。

群體感應(yīng)是細(xì)胞群體中，由于特定信號(hào)分子（如內(nèi)酯類）隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而不斷積累，在一定生長(zhǎng)密度下積累的信號(hào)分子可以誘導(dǎo)或關(guān)閉特定基因表達(dá)，是細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中響應(yīng)細(xì)胞密度的典型調(diào)控方式之一，目前已被廣泛用于代謝調(diào)控領(lǐng)域［61-62］。利用群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)導(dǎo)向內(nèi)源代謝路徑的代謝通量進(jìn)行可控限制，以增加碳源進(jìn)入目標(biāo)產(chǎn)物合成路徑的代謝通量，進(jìn)而動(dòng)態(tài)地控制大腸桿菌中糖酵解過(guò)程和產(chǎn)物合成途徑的代謝流，以平衡細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的協(xié)同，達(dá)到較優(yōu)的產(chǎn)物滴定度。該方法已用于合成莽草酸、葡萄糖二酸、肌醇、甜沒(méi)藥烯等［40，63-64］。

近年來(lái)，光遺傳工具的開(kāi)發(fā)也取得了較大的進(jìn)展，并逐步解決動(dòng)態(tài)調(diào)控中響應(yīng)速度慢、便攜性差、動(dòng)態(tài)表達(dá)能力低等難題。光感應(yīng)蛋白可以通過(guò)響應(yīng)不同波長(zhǎng)的光源形成單聚體或多聚體結(jié)構(gòu)，從而改變蛋白和特定核酸序列的結(jié)合能，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的可控調(diào)控。最近，研究報(bào)道在酵母中通過(guò)構(gòu)建光控動(dòng)態(tài)雙向調(diào)控系統(tǒng)，大幅提升異丁醇和2-甲基-1-丁醇的產(chǎn)量，其小試發(fā)酵罐產(chǎn)量分別高達(dá)8.49 g/L和2.38 g/L［41］。目前，光控系統(tǒng)還被用于控制蛋白發(fā)生快速、可逆的相分離，從而提高代謝通路中相關(guān)酶的催化效率以及實(shí)現(xiàn)更精細(xì)的代謝調(diào)控，以脫氧紫色桿菌素的合成為模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，最終產(chǎn)量提高6倍，產(chǎn)品特異性提高18倍，效果顯著［65］。

此外，基于溫度響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)也可被用于細(xì)胞代謝工程改造的相關(guān)研究。例如溫敏阻遏蛋白（CI857）是被研究和應(yīng)用最廣泛的。它在30oC時(shí)以單聚體的形式存在，從而結(jié)合并抑制lamda啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性；在37℃時(shí)，該蛋白形成二聚體從啟動(dòng)子區(qū)釋放出來(lái)，轉(zhuǎn)錄活性得以恢復(fù)。研究通過(guò)將重組細(xì)胞的培養(yǎng)溫度從37oC轉(zhuǎn)換到30℃，使得細(xì)胞在37℃表達(dá)保持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)所需的異檸檬酸脫氫酶，生長(zhǎng)期結(jié)束后調(diào)整溫度至30℃，抑制異檸檬酸脫氫酶的表達(dá)，以減少細(xì)胞代謝中α-酮戊二酸合成對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物合成的分流，因此細(xì)胞也將從生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)階段實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量提升［60］。

目前，光控和溫控調(diào)控系統(tǒng)得益于其本身輸入信號(hào)的可移除性，在代謝工程中有著更廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。但由于需要光敏和溫敏蛋白的表達(dá)，其表達(dá)水平對(duì)宿主全局代謝以及目標(biāo)代謝通路可能存在的影響需要謹(jǐn)慎評(píng)估，盡量減少系統(tǒng)噪音。其次，由于光控設(shè)備引入以及光在放大過(guò)程中的非均一性分布，也限制了光控在更大培養(yǎng)體系中的應(yīng)用。而基于群體感應(yīng)系統(tǒng)構(gòu)建的動(dòng)態(tài)調(diào)控線路，對(duì)于細(xì)胞密度的敏感性控制難度大，在放大培養(yǎng)中容易失活，但易于實(shí)現(xiàn)自調(diào)控。相對(duì)而言，基于代謝物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)與宿主有較好的相容性，也便于實(shí)現(xiàn)自調(diào)控，但響應(yīng)信號(hào)分子的篩選及其對(duì)應(yīng)生物傳感器的改造難度大。

2.3 動(dòng)態(tài)雙向調(diào)控

前文提到的單向動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)是目前研究最多、應(yīng)用最廣的調(diào)控方式之一。而相比于單向動(dòng)態(tài)調(diào)控，雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)不同基因或代謝路徑的激活和抑制表達(dá)［66］。近年來(lái)，因?yàn)殡p向動(dòng)態(tài)調(diào)控可實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的控制邏輯，為代謝調(diào)控提供更多元化的選擇，在代謝工程改造中有較好的靈活性，關(guān)于雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控的研究報(bào)道也越來(lái)越多［67-69］。

目前，動(dòng)態(tài)雙向調(diào)控主要應(yīng)用于解決細(xì)胞前期生長(zhǎng)和后期產(chǎn)物合成的矛盾，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)合成通路及與其競(jìng)爭(zhēng)的生長(zhǎng)依賴型代謝通路之間的分段式調(diào)控，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累的最大化［70-72］。如研究結(jié)合光控動(dòng)態(tài)表達(dá)系統(tǒng)和非門(mén)基因電路設(shè)計(jì)的動(dòng)態(tài)雙向調(diào)控在酵母中實(shí)現(xiàn)異丁醇的高產(chǎn)［41］。此外，Dinh等［62］通過(guò)組合基于同一種內(nèi)酯分子（OC6）響應(yīng)的抑制型和激活型兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)，構(gòu)建了感應(yīng)細(xì)胞密度的雙向動(dòng)態(tài)自調(diào)控系統(tǒng)，分別在重組大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)柚皮素和水楊酸的高效合成。

除此之外，動(dòng)態(tài)雙向調(diào)控目前還可以被用于合成人工定制化的生物大分子（圖3-B），比如嵌段型蛋白復(fù)合體［43］、高分子生物聚酯材料等。

3 動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建及表征

3.1 動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建

動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)一般主要由3部分組成，包括輸入信號(hào)，信號(hào)處理模塊（生物傳感器），信號(hào)輸出（或執(zhí)行機(jī)構(gòu)）［73-75］。其中，這3個(gè)部分元件的選擇、改造以及組合方式，決定著動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的功能與性能。輸入信號(hào)可以為直接添加的化學(xué)分子（如阿拉伯糖、半乳糖、乙酸等）、外界物理?xiàng)l件（如光、溫度等）或者通過(guò)基因通路設(shè)計(jì)合成的生物分子（如群體感應(yīng)分子、RNA、脂肪酸、氨基酸等），如圖2所示。而生物傳感器的設(shè)計(jì)是整個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的關(guān)鍵［76］。目前主要的構(gòu)建方法包括響應(yīng)蛋白突變改造［77-78］、響應(yīng)蛋白復(fù)合體的組合設(shè)計(jì)［79-80］、響應(yīng)蛋白與核酸結(jié)合區(qū)域的設(shè)計(jì)［49］等，這類型方法均可以改變生物傳感器的“輸入-響應(yīng)”曲線，從而改變生物傳感器對(duì)輸入信號(hào)的響應(yīng)范圍和靈敏度、輸出值的動(dòng)態(tài)范圍、響應(yīng)閾值等參數(shù)（圖4-A），以匹配實(shí)際的應(yīng)用需求。

動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)在控制上一般需要滿足兩個(gè)要求，分別是可定時(shí)控制［81］和可控值輸出。定時(shí)控制可以很好地平衡細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成之間的關(guān)系，可控值輸出可以為目的產(chǎn)物合成提供適配的胞內(nèi)蛋白豐度的同時(shí)，盡可能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞系統(tǒng)能效轉(zhuǎn)換的最大化。

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，動(dòng)態(tài)調(diào)控在精細(xì)化生物合成中的作用將日趨重要，優(yōu)勢(shì)顯像。因此，動(dòng)態(tài)調(diào)控單元的組合使用，理論上將實(shí)現(xiàn)更為復(fù)雜多樣的控制邏輯。但是，目前受限于對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)的深入認(rèn)知，多層級(jí)（＞3層）信號(hào)傳遞的調(diào)控系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用中容易出現(xiàn)信號(hào)衰減甚至丟失而導(dǎo)致控制系統(tǒng)失活的現(xiàn)象［82］。因此，在動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的設(shè)計(jì)過(guò)程中，充分考量其簡(jiǎn)單易用性，能很好地保障其性能發(fā)揮的穩(wěn)定性和生物工程應(yīng)用的可放大性。此外，目前低層級(jí)信號(hào)級(jí)聯(lián)（≤3層）動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用仍具有重要的意義，因其不僅可以為未來(lái)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)奠定豐富的元件庫(kù)和研究基礎(chǔ)，而且還能啟發(fā)研究者更好地理解生命系統(tǒng)錯(cuò)綜復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖3 動(dòng)態(tài)調(diào)控的應(yīng)用展望

3.2 基于報(bào)告基因的系統(tǒng)表征

由于調(diào)控系統(tǒng)一般涉及復(fù)雜的信號(hào)傳遞，因此很難確定信號(hào)的識(shí)別和反饋控制。為了解決這個(gè)問(wèn)題，很多研究通常引入熒光報(bào)告基因編碼的熒光蛋白或基因簇（如綠色、紅色、黃色熒光蛋白等），通過(guò)檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)響應(yīng)性能表征。一般來(lái)講，基因元件的基礎(chǔ)表征對(duì)于元件的利用是極其重要的。元件本身的特性直接影響其在實(shí)際使用中的表現(xiàn)。例如，當(dāng)傳感器在無(wú)輸入狀態(tài)下的背景輸出較大時(shí)，不適用于對(duì)低表達(dá)敏感的基因的控制等［12］。

對(duì)于動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，除了傳感器本身的“輸入-響應(yīng)”關(guān)系表征外，還需要考慮傳感器在細(xì)胞不同生長(zhǎng)期的響應(yīng)表現(xiàn)［83］，以及響應(yīng)速度等特征（圖4-B）。因?yàn)閯?dòng)態(tài)調(diào)控在實(shí)際代謝工程的應(yīng)用中容易受細(xì)胞培養(yǎng)濃度的影響，往往在高細(xì)胞密度條件下失去功能。而傳感器對(duì)輸入的響應(yīng)速度對(duì)信號(hào)級(jí)聯(lián)式控制也至關(guān)重要［82］。最后，系統(tǒng)地評(píng)估傳感器與宿主之間的相容性，有利于改善因引入外源系統(tǒng)帶來(lái)的系統(tǒng)噪音影響［83］。目前，可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)方法對(duì)全局代謝系統(tǒng)進(jìn)行差異分析，以評(píng)估影響的顯著性［83］。同時(shí)，基于細(xì)胞生長(zhǎng)表型，如生長(zhǎng)的趨勢(shì)、營(yíng)養(yǎng)物代謝速率等參數(shù)，來(lái)進(jìn)行綜合性生物學(xué)評(píng)價(jià)［12］。結(jié)合以上評(píng)估方法，可以有效地提高動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)在不同培養(yǎng)規(guī)模下的可用性和穩(wěn)定性。

4 展望

動(dòng)態(tài)調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)在于輸入信號(hào)響應(yīng)，既包括響應(yīng)特定代謝物的生物傳感器構(gòu)建，也包括生物傳感器在更高細(xì)胞濃度下的有效響應(yīng)，這兩個(gè)技術(shù)難點(diǎn)目前仍是動(dòng)態(tài)調(diào)控的核心挑戰(zhàn)。尤其對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期后的基因表達(dá)調(diào)控。因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)胞內(nèi)外產(chǎn)物積累末期，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變化［84］或誘導(dǎo)裂解細(xì)胞釋放產(chǎn)品［85］便于下游分離提純，可以很大程度上解決細(xì)胞人工破壁的成本。除此之外，信號(hào)的快速輸入與移除，也將影響動(dòng)態(tài)調(diào)控的效率。如溫控的均一性好，但升溫降溫響應(yīng)存在滯后；而光控的輸入快，但是均一性差，且放大過(guò)程中裝置的設(shè)計(jì)或改造難度大。綜上所述，動(dòng)態(tài)調(diào)控在構(gòu)建可工業(yè)化應(yīng)用的細(xì)胞工廠中仍存在很多挑戰(zhàn)，并需要進(jìn)一步研究探索。但動(dòng)態(tài)調(diào)控仍然是代謝工程領(lǐng)域的一個(gè)高效、創(chuàng)新的重要技術(shù)方向。

最近，根據(jù) RNA 調(diào)控［86］和“蛋白 - 蛋白”調(diào)控［87］等研究表明，動(dòng)態(tài)調(diào)控未來(lái)有實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后或翻譯后調(diào)控的可能，從而減少目前基于中心法則的長(zhǎng)行程基因表達(dá)帶來(lái)的噪音和遲滯引發(fā)的不穩(wěn)定性，同時(shí)也可以實(shí)現(xiàn)更快速、精準(zhǔn)的輸入和輸出響應(yīng)，強(qiáng)化代謝調(diào)控的特異性。

另外，動(dòng)態(tài)調(diào)控與其他代謝工程改造方法的創(chuàng)新性組合使用也有利于細(xì)胞工廠在產(chǎn)物合成中產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率（TYP：Titer，Yield，Productivity）的進(jìn)一步提升［88］。如結(jié)合靜態(tài)和動(dòng)態(tài)調(diào)控的各自優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)在時(shí)間和表達(dá)水平上的最優(yōu)化組合。靜態(tài)調(diào)控可以通過(guò)基因敲除、啟動(dòng)子或RBS改造等方法，將目標(biāo)合成路徑的代謝流進(jìn)行調(diào)諧，有效地導(dǎo)引底物向產(chǎn)物的催化轉(zhuǎn)化，減少副產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的積累；而動(dòng)態(tài)調(diào)控可以控制激活合成通路和抑制競(jìng)爭(zhēng)旁路的時(shí)機(jī)。從而當(dāng)依據(jù)靜態(tài)調(diào)控水平去激活目標(biāo)基因表達(dá)時(shí)，既保證了細(xì)胞在對(duì)數(shù)期的正常生長(zhǎng)，又實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠高效的產(chǎn)物積累（圖3-A）。以大腸桿菌合成肌醇和葡萄糖二酸為例，研究者已通過(guò)構(gòu)建感應(yīng)細(xì)胞密度的生物傳感器，調(diào)控葡萄糖-6-磷酸（G6P）的下游代謝分流。即在低細(xì)胞密度的條件下，葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入糖酵解和磷酸戊糖途徑供給細(xì)胞生長(zhǎng)，在高細(xì)胞密度下，葡萄糖-6-磷酸則作為肌醇合成的底物，從而提高肌醇和葡萄糖二酸的產(chǎn)量［40］。因此，被激活的肌醇或葡萄糖二酸的合成通路可以先通過(guò)基因表達(dá)調(diào)諧來(lái)確定合適的表達(dá)強(qiáng)度，然后再通過(guò)細(xì)胞密度傳感器來(lái)激活表達(dá)，以減少過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)載的代謝負(fù)荷（圖 3-A）［89］。

圖4 生物傳感器的表征

此外，從光控誘導(dǎo)合成異丁醇的生物發(fā)酵過(guò)程可得，動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)與基因振蕩器聯(lián)用控制目標(biāo)基因表達(dá)也可能帶來(lái)更好的產(chǎn)品積累量。研究基于光控動(dòng)態(tài)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)酵母中乙醇和異丁醇的合成通路的關(guān)鍵酶進(jìn)行定時(shí)的激活和抑制控制［41］。有趣的是，在小試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，在特定時(shí)間激活異丁醇合成通路表達(dá)后，間歇式的光控誘導(dǎo)所合成的產(chǎn)物濃度比持續(xù)性的誘導(dǎo)方式要高。因此，在激活未經(jīng)調(diào)諧的代謝通路時(shí)，采用間歇式的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式可以減少細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的過(guò)度積累，從而維持細(xì)胞正常的代謝水平和提高產(chǎn)物合成效率（圖3-C）。

除代謝工程改造以外，動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)還可以用于研究微生物群落［90-93］、細(xì)胞靶向藥物釋放［94］、細(xì)胞表型變化［95］、相分離控制［65］等領(lǐng)域。尤其是多個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控單元級(jí)聯(lián)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建［42］，既可用于構(gòu)建仿細(xì)胞代謝調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)［96］，也有利于研究者深入探索和解析復(fù)雜的細(xì)胞代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。隨著更多生物傳感器的開(kāi)發(fā)，以及工程化理性設(shè)計(jì)的發(fā)展，結(jié)合日漸豐富先進(jìn)的生物技術(shù)，如高通量自動(dòng)化平臺(tái)、DNA合成及測(cè)序等，細(xì)胞工廠的工程化改造將實(shí)現(xiàn)快周期、智能化、高效率的革命性突破。