電子束處理對茄子種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

朱宗文，吳雪霞，張愛冬，查丁石

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所,上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201403)

物理輻射誘變是引起作物遺傳物質(zhì)變異，獲得作物新種質(zhì)的有效途徑，在我國農(nóng)作物育種和園藝作物育種中被廣泛應(yīng)用，創(chuàng)造了十分可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]。電子直線加速器是一種利用高頻電場加速沿直線形軌道運(yùn)動的電子諧振加速裝置，在農(nóng)產(chǎn)品和食品滅菌保鮮方面已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[4-9]。電子束作為一種誘變源近年來在植物育種上也得到了一定的應(yīng)用[10-12]，但在蔬菜新品種選育中應(yīng)用較少。茄子是我國一種重要的蔬菜，已有上千年的栽培歷史。由于地方品種眾多，種植地域性較強(qiáng)，且與國外優(yōu)質(zhì)品種存在一定差異，因而搜尋和創(chuàng)造優(yōu)良茄子種質(zhì)資源具有十分重要的意義。本研究采用不同劑量的電子束輻照處理2個(gè)茄子高代自交系材料的種子，探討電子束處理對茄子不同萌發(fā)狀態(tài)種子的誘變效應(yīng)，旨在為其輻照誘變育種適宜劑量的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料07-15和25-5為高代自交系茄子，種子由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所提供。根據(jù)試驗(yàn)處理不同材料種子分別編號為：C1(07-15干種子)，C1y(07-15 PEG滲透調(diào)節(jié)引發(fā)種子)，C2(25-5干種子)，C2y(25-5 PEG滲透調(diào)節(jié)引發(fā)種子)。試驗(yàn)所用種子為同一批次，并經(jīng)發(fā)芽試驗(yàn)觀測發(fā)芽率一致，原始含水量為8%。

1.2 方法

1.2.1 PEG滲透調(diào)節(jié)引發(fā)處理

將干種子用0.3% NaClO消毒5 min，用蒸餾水清洗干凈后放入25% PEG(PEG-6000)中進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)引發(fā)處理，溶液完全浸沒種子，溫度為25 ℃。每天更換1次引發(fā)溶液，引發(fā)時(shí)間為5 d。引發(fā)結(jié)束后用蒸餾水將種子快速清洗干凈，用濾紙吸干表面水分后于35 ℃晾干至處理前含水量(8%)。

1.2.2 電子加速器處理

將干種子和經(jīng)引發(fā)的種子分別裝入牛皮紙袋內(nèi)，在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院束能輻照技術(shù)有限公司用ESS-010-03型電子直線加速器輻照裝置(日本IHI公司)進(jìn)行電子加速器輻照處理，額定能量為10 Mev，功率10 kW。輻照劑量分別為200 Gy、300 Gy、400 Gy、500 Gy、600 Gy、700 Gy、800 Gy、900 Gy和1 000 Gy，以未輻射的干種子和引發(fā)種子為對照。

1.2.3 發(fā)芽試驗(yàn)

用透明塑料發(fā)芽盒(12 cm×12 cm×5 cm)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每粒種子間留有種子直徑5倍的間距。將種子放入鋪有兩層發(fā)芽紙的發(fā)芽盒中，30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽。每處理100粒種子，3次重復(fù)。按農(nóng)作物種子檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)，第7天測定種子發(fā)芽勢，第14天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，計(jì)算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽率(Gr)=∑Gt/NT×100 %，發(fā)芽指數(shù)(Gi)=∑(Gt/Dt)，活力指數(shù)(Vi)=Gi×S。其中，Gt表示在t日的發(fā)芽數(shù)，Dt表示相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)，NT表示種子總數(shù)，S表示發(fā)芽終期幼苗的高度(cm)。

1.2.4 種子萌發(fā)后胚根測量和根系活力測定

種子萌發(fā)結(jié)束后，對各輻照劑量處理萌發(fā)幼苗進(jìn)行胚根長度的測定，然后對胚根進(jìn)行根系活力的測定。根系活力測定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法，以單位質(zhì)量鮮根的TTC還原強(qiáng)度表示[13]。

1.2.5 出苗率和幼苗存活率觀測

將電子束處理的種子播種在育苗盤中，每個(gè)輻照劑量播種1 000粒，統(tǒng)計(jì)出苗率。兩周后統(tǒng)計(jì)幼苗存活率。出苗率=出苗數(shù)/播種數(shù)×100%；幼苗存活率=存活苗數(shù)/出苗數(shù)×100%。

1.2.6 幼苗生長觀測

每個(gè)輻照劑量選取幼苗100株定植于32孔穴盤中，待對照為六片真葉時(shí)對幼苗生長和生物量積累情況進(jìn)行觀測，并對畸形苗和發(fā)育異常苗進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束處理對茄子種子萌發(fā)的影響

電子束處理對茄子種子萌發(fā)產(chǎn)生了顯著影響(表1)。當(dāng)輻照劑量≥700 Gy時(shí)，C1處理的發(fā)芽率與對照相比顯著下降，1 000 Gy時(shí)發(fā)芽率為41.7%，種子萌發(fā)受到極大限制；Gi和Vi在輻照劑量≥400 Gy時(shí)顯著低于對照。當(dāng)輻照劑量≥700 Gy時(shí)，C1y處理對電子束輻照較C1處理更為敏感。當(dāng)輻照劑量≥600 Gy時(shí)，C2處理的發(fā)芽率與對照相比顯著下降，1 000 Gy時(shí)發(fā)芽率僅為38.7%；Gi在輻照劑量≥600 Gy時(shí)顯著低于對照，Vi在輻照劑量≥300 Gy時(shí)顯著低于對照。當(dāng)輻照劑量<600 Gy時(shí)，C2y處理的發(fā)芽率與C2較為一致，輻照劑量≥600 Gy時(shí)，C2y處理的發(fā)芽率下降幅度大于C2；電子束處理后C2y的Vi敏感性高于Gi。結(jié)果表明，2個(gè)茄子材料的干種子和引發(fā)種子對電子束處理的敏感性不同；Vi下降幅度大于Gi主要是因?yàn)檩椛涮幚硪种屏伺哐亢团吒纳L。

表1 不同劑量電子束處理對茄子種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母代表存在顯著差異(P<0.05)，下同

2.2 電子束處理對茄子種子萌發(fā)后幼苗生長的影響

從圖1和圖2可以看出，電子束處理后，茄子幼苗形態(tài)受到顯著影響。由于高于600 Gy的電子束處理種子發(fā)芽后基本處于露白的生長停滯狀態(tài)，所以未對其胚芽和胚根進(jìn)行測量。隨著輻照劑量的上升，幼苗生長受到的限制越顯著。C1和C1y處理在輻照劑量達(dá)到600 Gy時(shí)胚根伸長幅度大大受到限制，基本處于生長停滯狀態(tài)；C2和C2y處理在輻照劑量達(dá)到400 Gy時(shí)胚根生長受到嚴(yán)重影響，高于500 Gy后基本處于生長停滯狀態(tài)。從圖3可以看出，C2和C2y處理在輻照劑量低于200 Gy處理時(shí)，根系活力強(qiáng)于C1和C1y處理，當(dāng)輻照劑量高于300 Gy時(shí)，C2和C2y處理的胚根根系活力下降快于C1和C1y處理?？傮w上看，C2和C2y處理隨著輻照劑量增大胚根生長受到抑制程度大于C1和C1y處理，表明2個(gè)材料對輻射的敏感性不同。

2.3 電子束處理對茄子種子出苗和幼苗存活率的影響

對各輻照劑量處理的種子播種后統(tǒng)計(jì)出苗率，并在出苗2周后統(tǒng)計(jì)幼苗存活情況(圖4)。經(jīng)不同輻照劑量處理后，07-15干種子出苗率最高，25-5干種子和07-15引發(fā)種子出苗率基本一致，25-5引發(fā)種子在輻照劑量≥600 Gy時(shí)出苗率最低。電子束處理后2個(gè)茄子材料的幼苗存活率與出苗率總體趨勢一致，存活率表現(xiàn)最好的是07-15干種子，表現(xiàn)最差的是25-5引發(fā)種子。茄子幼苗存活率為50%時(shí)，輻照劑量分別為：07-15干種子(C1)600 Gy，07-15引發(fā)種子(C1y)500 Gy，25-5干種子(C2)500 Gy,25-5引發(fā)種子(C2y)400 Gy。

2.4 電子束處理茄子種子的半致死劑量(LD50)

在輻射育種中，一般選取半致死劑量LD50(照射種子或者某一器官成活率占50%的劑量)作為誘變育種的合適輻照劑量[14]。從種子萌發(fā)(表1)、幼苗存活(圖4)以及幼苗胚根生長情況可以得出，電子束處理的半致死劑量(LD50)：C1為600 Gy左右，C2為500 Gy左右，C1y為500 Gy左右，C2y為400 Gy左右。經(jīng)25%PEG滲透調(diào)節(jié)引發(fā)處理的種子對電子束較敏感，其LD50低于干種子100 Gy左右。

2.5 LD50處理對茄子幼苗生長發(fā)育的影響

2個(gè)茄子材料的干種子和引發(fā)種子LD50處理后，幼苗生長指標(biāo)與對照相比受到顯著影響(表2)，表現(xiàn)最為顯著的是株高，其中C1yLD50處理后株高表現(xiàn)最好，達(dá)到了10cm以上；莖粗、鮮重和干重較對照均顯著降低。LD50處理后，2個(gè)茄子材料的幼苗畸變率均超過了50%，其中引發(fā)種子的幼苗畸變率在80%以上，這對從中獲取茄子新種質(zhì)資源大有幫助。

表2 LD50處理對茄子幼苗生長的影響

3 討論

在農(nóng)作物種子輻射誘變中，一般隨著輻照劑量增加，種子發(fā)芽率和種子活力下降明顯，幼苗存活率也迅速下降，因此輻照劑量的選擇尤為重要。半致死劑量(LD50)既能保證幼苗一定的存活量，又能保證輻射后細(xì)胞產(chǎn)生有利突變的概率，在輻射誘變育種中被廣泛采用[14]。本試驗(yàn)中超過600 Gy的電子束輻照處理大大降低了種子的萌發(fā)率，并對種子活力產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。不同材料間輻射敏感性存在差異，07-15抗輻射能力強(qiáng)于25-5。不同萌發(fā)狀態(tài)種子對電子束的敏感性也存在一定的差異，通過發(fā)芽試驗(yàn)和幼苗存活試驗(yàn)可以看出，滲透調(diào)節(jié)引發(fā)處理使種子內(nèi)預(yù)發(fā)芽代謝活動產(chǎn)生變化，對輻射敏感性也產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)確定了2個(gè)茄子材料合適的半致死劑量(LD50)，為今后茄子電子束輻射育種提供了參考。物理輻射誘變育種作為一種提高染色體變異的有效手段在農(nóng)作物育種中被廣泛使用[15-19]。近年來電子束輻照處理作為一種無輻射源的新型輻照技術(shù)，在國內(nèi)應(yīng)用廣泛，已成為一種理想的γ射線輻照替代技術(shù)，并在農(nóng)作物育種中得到很好的應(yīng)用[20]。張啟明等[21]用10—15 Gy劑量電子束輻照睡蓮‘科羅拉多’植株，在輻照后第二年和第三年均出現(xiàn)變異株,RAPD分析表明，電子束處理可引起花色基因的變異。翟敬宇[11]研究發(fā)現(xiàn)，用電子束輻照翠竹種苗可以引起葉色、葉形和株高發(fā)生顯著變異，RAPD分析表明，電子束處理使翠竹基因組DNA發(fā)生了變異。王陽等[10]研究發(fā)現(xiàn)，電子束輻照百合鱗莖能夠引起百合植株DNA發(fā)生變異，且一定范圍內(nèi)的合適輻照劑量與誘變頻率呈正相關(guān)。黃強(qiáng)等[22]研究發(fā)現(xiàn)，電子束輻照玉米種子可以在M3代株系中引起豐富的遺傳變異。張容等[23]利用電子束輻照小麥干種子，引起了豐富的變異。本研究發(fā)現(xiàn)，電子束處理對不同萌發(fā)狀態(tài)的茄子種子萌發(fā)和植株生長產(chǎn)生了顯著的影響。處理后早期幼苗上胚軸子葉帶帽現(xiàn)象嚴(yán)重，下胚軸生長受到顯著抑制，并隨輻照劑量增大表現(xiàn)更為明顯。幼苗存活率表明，超過合適劑量的輻照處理大大降低了幼苗的存活率，幼苗死亡的原因主要是由于過強(qiáng)的輻照嚴(yán)重抑制了下胚軸的生長，幼根處于生長停滯狀態(tài)，不能進(jìn)行水分和養(yǎng)分的吸收。存活幼苗植株體形態(tài)變異明顯，主要表現(xiàn)為葉片大小的變化、分枝數(shù)量的增加、主莖矮化嚴(yán)重和須根根系復(fù)雜化。這些植株體形態(tài)的變化很可能是其遺傳物質(zhì)變異的外在表現(xiàn)，后續(xù)試驗(yàn)將對其后代繼續(xù)進(jìn)行種植并對其遺傳物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析，以期找到表現(xiàn)優(yōu)異的變異株，為茄子育種種質(zhì)創(chuàng)新提供幫助。