低溫堿性蛋白酶芽孢桿菌的篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

石慧 莫晨陽(yáng) 金喆昊

[摘要]本研究從學(xué)院食堂附近的土樣、人工湖水樣和鯽魚(yú)、鯰魚(yú)的腸道中分離得到6株產(chǎn)蛋白酶菌株。經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩后，選擇產(chǎn)酶活高的菌株2、菌株5和菌株6進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和部分酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明菌株2可能為短短芽孢桿菌，菌株5可能為蘇云金芽孢桿菌，菌株6可能為地衣芽孢桿菌。研究3株菌所產(chǎn)蛋白酶的最適pH，發(fā)現(xiàn)2號(hào)、5號(hào)和6號(hào)菌株的最適pH分別為6.0、8.0和10.0。菌株5和菌株6所產(chǎn)蛋白酶在pH為8.0～10.0的緩沖液中處理30min后活性幾乎不變，在堿性環(huán)境中均具有較好的穩(wěn)定性。菌株5和菌株6所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度均為30℃，低于30℃處理30min活性幾乎不變;50℃處理30min后，菌株5和菌株6的殘余酶活分別20%和40%。

[關(guān)鍵詞]低溫堿性蛋白酶;芽孢桿菌;篩選;鑒定;酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：Q78;Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202001

低溫堿性蛋白酶通常指在pH為堿性條件下，0℃～30℃內(nèi)催化效率較高，對(duì)熱相對(duì)不穩(wěn)定的一類蛋白酶[1]。低溫堿性蛋白酶主要由嗜低溫菌和耐低溫菌產(chǎn)生[2]，包括假單胞桿菌屬、芽孢桿菌屬和黃桿菌屬等[3]。多數(shù)微生物的堿性蛋白酶還具有水解酯鍵、酰胺鍵、轉(zhuǎn)酯和轉(zhuǎn)肽的能力，因此被用于植物蛋白加工行業(yè)，特別是用于大豆蛋白的降解，增加其營(yíng)養(yǎng)效價(jià)[4-5]。目前，食品、水產(chǎn)飼料、洗滌劑行業(yè)和化妝品行業(yè)所用的蛋白酶主要是中溫堿性蛋白酶，其最適作用溫度通常為50℃～70℃。而這些產(chǎn)品的使用溫度在發(fā)展中國(guó)家通常在40℃以下，低溫堿性蛋白酶在這些產(chǎn)品中替代中溫堿性蛋白酶具有巨大的優(yōu)越性[6-8]，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究篩選的幾株低溫堿性蛋白酶芽孢桿菌均具有較強(qiáng)的酶活，具有一定研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來(lái)源：武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食堂后土樣、武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院人工湖水樣、鯽魚(yú)腸道、鯰魚(yú)腸道。

初篩培養(yǎng)基：干酪素4.0g，KH2PO4 0.36g，Na2HPO4·7H2O 1.07g， NaCl 0.16g，CaCl2·2H2O 0.002g，MgSO4·7H2O 0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002g，胰蛋白胨0.05g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，干酪素0.8%，酵母膏0.1%，葡萄糖0.1%，氯化鈉0.58%，檸檬酸三鈉0.45%，瓊脂2%，pH為8.0。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的初篩

稱樣品10g稀釋至10-5，取0.1mL 10-5稀釋液涂布在初篩培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)36h后，觀察長(zhǎng)出的菌落周?chē)业鞍姿馊Ξa(chǎn)生的情況，挑取酪蛋白水解圈較大的菌落，劃線分離純培養(yǎng)并保存。

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌初酶液的制備

將篩選的細(xì)菌以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，180r/min，28℃搖瓶培養(yǎng)36h，8 000r/min離心20min，取上清液，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除去殘余的菌體，獲得各菌株發(fā)酵液的無(wú)菌上清液即為粗酶液。

1.2.3 堿性蛋白酶活力的測(cè)定

堿性蛋白酶活的測(cè)定方法參考陳琳[7]的《產(chǎn)低溫蛋白酶菌株Halomonassp.SD-02的分離鑒定及其酶的提純與特性研究》，酶活力單位定義參照《酶制劑工業(yè)》[9]。

1.2.4 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的復(fù)篩

用1.2.2中方法制備粗酶液，1.2.3法測(cè)定各菌株粗酶液的堿性蛋白酶活力，粗酶液和酪蛋白均用0.1 M Na2CO3/NaHCO3（pH=10.0）緩沖液稀釋或溶解。選擇堿性蛋白酶活力相對(duì)高的菌株為供試菌株。

1.2.5 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的鑒定

1.2.5.1 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的形態(tài)鑒定

10×100放大倍數(shù)下觀察用堿性復(fù)紅染色的菌株的形態(tài)、大小、芽孢的著生位置等并拍照;觀察菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)并拍照。

1.2.5.2 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的生理生化鑒定

各菌株的生理生化鑒定項(xiàng)目見(jiàn)表2。

1.2.6 菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適作用pH的測(cè)定

將1.2.3中酶促反應(yīng)的pH分別用檸檬酸鹽/磷酸、磷酸緩沖液、碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液調(diào)節(jié)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，測(cè)定各菌株的粗酶液在不同酶促反應(yīng)pH中的蛋白酶活力。

1.2.7 各菌株所產(chǎn)的堿性蛋白酶對(duì)pH的穩(wěn)定性測(cè)定

將各菌株的粗酶液分別用乙酸/乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，用碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH至9.0、10.0、11.0、12.0處理30min，用福林酚試劑法測(cè)定各粗酶液的堿性蛋白酶活力。

1.2.8 菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適作用溫度的測(cè)定

將1.2.3中酶促反應(yīng)的水浴溫度分別設(shè)定為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，測(cè)定各菌株的粗酶液在不同酶促反應(yīng)溫度中的堿性蛋白酶活力。

1.2.9 菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定

將各菌株的粗酶液分別在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 、70℃水浴30min，用福林酚試劑法測(cè)定其堿性蛋白酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的篩選結(jié)果與分析

2.1.1 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的初篩結(jié)果與分析

產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌在初篩平板上28℃恒溫培養(yǎng)36h后，不同菌落產(chǎn)生酪蛋白水解圈大小不同，選取水解圈大的菌落共計(jì)6株，見(jiàn)圖1。

2.1.2 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的復(fù)篩結(jié)果與分析

測(cè)定6株產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的（pH=10.0）堿性蛋白酶活，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，菌株2、菌株5和菌株6粗酶液的堿性蛋白酶活力相對(duì)較高，鑒定這3個(gè)菌株。

2.2 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的鑒定結(jié)果

2.2.1 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的形態(tài)鑒定結(jié)果

鏡檢菌株2、菌株5和菌株6的個(gè)體形態(tài)特征圖片及這3株細(xì)菌的劃線分離純培養(yǎng)單菌落圖片見(jiàn)圖2。

結(jié)果顯示，這33株菌株個(gè)體形態(tài)及菌落形態(tài)都有明顯的差異，為不同的菌種。

它們鏡檢都能看到芽孢。菌株2菌落呈黃色，透明，濕潤(rùn)，邊緣規(guī)則;菌株5菌體在顯微鏡下常成鏈狀排列，菌落呈乳白色，不透明，濕潤(rùn);菌株6芽孢與菌株5類似，菌體更短小，細(xì)胞間排列無(wú)規(guī)則，菌落前期濕潤(rùn)透明，后期干燥、多褶皺，中間和邊緣凹陷。

2.2.2 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果與分析

菌株2、菌株5和菌株6生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)合這3個(gè)菌株的形態(tài)及生理生化鑒定的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，推測(cè)菌株2可能為類短芽孢桿菌屬中的短短芽孢桿菌，菌株5可能為芽孢桿菌屬蘇云金芽孢桿菌，菌株6可能為芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌。

2.3 菌株所產(chǎn)的堿性蛋白酶的部分性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.3.1 菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH 結(jié)果與分析

見(jiàn)圖3可知，當(dāng)只改變蛋白酶酶活測(cè)定pH時(shí)，菌株2所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為6.0，其所產(chǎn)蛋白酶在pH 7.0～10.0酶活大幅下降，pH為11.0時(shí)，酶完全失活;菌株5所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為8.0，pH 9.0～10.0酶活小幅下降，pH為11.0時(shí)，酶完全失活;菌株6所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為10.0，pH為11.0時(shí)，酶活開(kāi)始急劇下降。鑒于菌株2實(shí)際產(chǎn)酸性蛋白酶，只是在堿性pH范圍蛋白酶有一定的耐受性，在之后的研究中剔除菌株2。

2.3.2 各菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適作用溫度結(jié)果與分析

由圖4可知，菌株5的蛋白酶的最適作用溫度為30℃，在25℃～35℃蛋白酶活力小幅下降，在50℃完全失活;菌株6的蛋白酶的最適作用溫度為30℃，在35℃～50℃蛋白酶活力小幅下降。

2.3.3 菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶對(duì)pH的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果與分析

菌株5產(chǎn)蛋白酶在pH 7.0～9.0較穩(wěn)定，酶活力波動(dòng)不大，接近最高酶活，在pH 3.0～4.0及pH 11.0時(shí)，酶完全失活;菌株6所產(chǎn)蛋白酶pH8.0～10.0較穩(wěn)定，酶活力波動(dòng)不大，pH接近10.0時(shí)酶活最高，在pH 3.0～4.0時(shí)，酶完全失活;pH為11.0時(shí)，酶活急劇下降（見(jiàn)圖5）。

2.3.4 各菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果與分析

菌株5和菌株6所產(chǎn)蛋白酶在20℃～30℃均較穩(wěn)定，20℃～30℃處理30min酶活幾乎不變。當(dāng)溫度超過(guò)30℃，隨著溫度的升高，酶活逐步降低。50℃保溫30min后，菌株5的酶活降低到20%左右，菌株6的酶活降低到40%左右，可見(jiàn)兩株菌所產(chǎn)蛋白酶的熱穩(wěn)定性均較差，菌株6略好于菌株5（見(jiàn)圖6）。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)篩選出3株產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌，菌株2為短短芽孢桿菌，菌株5為蘇云金芽孢桿菌，菌株6為地衣芽孢桿菌。其中菌株2所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為6.0，為酸性蛋白酶產(chǎn)生菌。菌株5所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為8.0;菌株6所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為10.0，均為堿性蛋白酶產(chǎn)生菌株。

菌株5所產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度為30℃，在25℃～35℃蛋白酶活力小幅下降，在50℃完全失活;菌株6的蛋白酶的最適作用溫度為30℃，在35℃～50℃蛋白酶活力小幅下降。

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