艾煙和香煙煙霧對弱精子癥模型大鼠的影響

劉雅潔 安雨 金滋潤 西珂 霍涌瑋 邢國剛 趙百孝

摘要? 目的：研究艾煙和香煙煙霧對弱精子癥模型大鼠的影響。方法：將32只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為溶劑組、模型組、艾煙組和香煙組4組，每組8只。通過灌胃給予奧硝唑溶液建立弱精子癥大鼠模型。計算機輔助精子分析系統(tǒng)用于檢測艾煙和香煙煙霧對于弱精子癥模型大鼠的精子活力、活率和密度等指標的影響。結(jié)果：與模型組比較，艾煙干預可以明顯改善弱精子癥模型大鼠的精子活力、活率和曲線速度（VCL）、直線運動速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）等功能指標;香煙組的精子活力、活率和VCL、VSL、VAP等功能指標均顯著低于溶劑組和艾煙組。各組大鼠的精子密度無顯著變化。結(jié)論：艾煙和香煙煙霧對機體產(chǎn)生的效應(yīng)不同，艾煙可以提高弱精子癥模型大鼠的精子活力、活率和運動能力，對弱精子癥有一定的改善作用。

關(guān)鍵詞? 弱精子癥;艾煙;香煙;計算機輔助精子分析;精子運動

Experimental Study on Intervention of Asthenozoospermia Model by Moxa Smoke and Cigarette Smoke on Rats

LIU Yajie1，AN Yu1，JIN Zirun2，XI Ke2，HUO Yongwei3，XING Guogang2，ZHAO Baixiao4

（1 School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Neuroscience Research Institute of Peking University，Beijing 100191，China; 3 Research Center of Reproductive Medicine，School of Basic Medical Sciences，Xi′an Jiaotong University Health Science Center，Xi′an 710061，China; 4 School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective： To investigate the effects of moxa smoke and cigarette smoke on asthenozoospermia in rats. Methods： A total of 32 male rats were randomly divided into a vehicle group，a model group，a moxa smoke group and a cigarette smoke group，with 8 rats in each group.Asthenozoospermia model was established by intragastric administration of ornidazole.The effects of moxa smoke and cigarettes on the indexes of sperm motility，viability，density etc.were observed by computer-assisted sperm analysis system. Results： Compared with model group，moxa smoke can significantly improve sperm motility，viability，as well as other functional indicators including curve-line velocity（VCL），straight-line velocity（VSL），and average path velocity（VAP）.The sperm motility，viability，VCL，VSL，VAP and other functional indicators in cigarette group were significantly lower than those in vehicle group and moxa smoke group.There was no significant change on sperm density in each group. Conclusion： Moxa and cigarette smoke have different effects on the body.Moxa can increase sperm motility，viability，and exercise capacity in rats with asthenozoospermia，and has certain effects on improving asthenospermia.

Keywords? Asthenozoospermia; Moxa smoke; Cigarette smoke; Computer-assisted sperm analysis; Sperm motility

中圖分類號：R259 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.04.014

流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在過去的半個世紀中，男性精液中的精子數(shù)量和運動參數(shù)都表現(xiàn)出顯著的下降趨勢[1]。弱精子癥是以精子活力下降和運動能力低下為主要表現(xiàn)。艾灸療法是將艾灸點燃后應(yīng)用于針灸穴位或體表特定部位進行燒灼和熏燙，給予熱、光、煙和藥物刺激，通過經(jīng)絡(luò)的傳導，刺激體內(nèi)經(jīng)氣的活動，使氣血調(diào)達，起到扶助正氣和防治疾病的效果。艾煙作為艾灸燃燒產(chǎn)物中不可或缺的重要組成部分，具有特殊的芳香氣味和多種生物活性，已經(jīng)成為艾灸發(fā)揮其治療效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，艾煙對雄性Wistar大鼠的生殖功能具有促進作用，能夠提高大鼠的精子密度、精子活力和前向運動能力，促進睪酮分泌[3]。本研究系統(tǒng)觀察了艾煙和香煙煙霧對弱精子癥模型大鼠的精子活力和運動能力等指標的影響，探討艾煙和香煙對機體不同的作用原理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本實驗選用32只體質(zhì)量為200～230 g的健康成年雄性SD大鼠，實驗動物購自北京維通利華實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。所有大鼠均可自由進食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～22 ℃，濕度為50% ～55%。采用人工控制室內(nèi)照明，保持12 h光照（8：00～20：00）和黑暗（20：00～次日8：00）交替循環(huán)。實驗過程遵循2006年國家科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

1.1.2 藥物 奧硝唑（北京華威銳科化工有限公司，批號：HWBD017918），羧甲基纖維素鈉（百奧百樂生物科技有限公司，批號：RH30501）。奧硝唑溶液制備方法：將奧硝唑加入1 mL 0.2%羧甲基纖維素鈉溶液中，然后加入2滴50 L Tween-20，在干凈的研缽中研磨至均勻無顆粒[5]。

1.1.3 試劑與儀器 清艾條（湖北李時珍中藥飲片有限公司，規(guī)格：長20～21 cm，直徑1.9～2.1 cm，國藥準字Z20163081），香煙（廣東中煙工業(yè)有限責任公司，紅雙喜牌，焦油量：11 mg），玻璃缸（自制，80 cm×80 cm×60 cm，側(cè)面設(shè)有直徑2 cm的圓孔），光散射式數(shù)字微電腦粉塵儀（北京賓達綠創(chuàng)科技有限公司，型號：P-5L2C型）;水浴鍋（北京長風儀器有限公司，型號：SHH.W21.500），精子計數(shù)板（南寧松景天倫生物科技有限公司，型號：ML-CASA 20），計算機輔助精子分析系統(tǒng)（北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司，型號：WLJY-9000）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按體質(zhì)量隨機分為4組：溶劑組、模型組、艾煙組和香煙組，每組8只。除溶劑組外，其他各組大鼠均給予奧硝唑溶液灌胃，每次400 mg/kg，連續(xù)灌胃10 d，建立弱精子癥大鼠模型[4]。造模之后，奧硝唑的劑量減半，1次/d，每次200 mg/kg，直至艾煙和香煙煙霧干預結(jié)束。溶劑組大鼠每天給予配制好的0.2%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃作為對照。

1.2.2 干預方法 奧硝唑溶液灌胃第11天開始進行艾煙和香煙煙霧干預。用自制的固定器固定好大鼠，防止其自由活動而被燃燒的艾條燙傷，然后將整組大鼠和粉塵測試儀放入玻璃缸內(nèi)，從玻璃缸側(cè)面的圓孔插入艾條的燃燒端，使煙霧均勻地填充整個玻璃容器。當粉塵測試儀檢測到玻璃缸內(nèi)的煙霧濃度達到10～15 mg/m3時，取出燃燒的艾條并快速密封圓孔，然后每隔3 min記錄1次玻璃缸內(nèi)的煙霧濃度，將濃度始終保持在預定的范圍內(nèi)[6]。香煙組操作同艾煙組。干預1次/d，持續(xù)20 min/次，每周6 d，共8周。

1.2.3 檢測指標與方法 各組大鼠在艾煙和香煙煙霧干預結(jié)束后1 d，斷頸處死，快速取出雙側(cè)附睪尾部，將其放入含有2 mL 0.9%氯化鈉溶液的一次性培養(yǎng)皿中，用小剪刀在附睪尾部輕輕剪2刀，置于37 ℃水浴鍋中2 min，輕輕混勻，使用移液槍吸取20 L加入到精子計數(shù)板上，選取6個視野，于2 min內(nèi)完成測試[5]。計算機輔助精子分析系統(tǒng)用于檢測大鼠附睪精子的功能指標[7]，包括精子活力、活率、密度和各種精子運動指標等。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SAS 9.4統(tǒng)計軟件分析所有的數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)使用均數(shù)標準差 （ ±s） 表示。首先通過單因素方差分析法進行分析，當每組之間的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義時，再進行LSD-t檢驗，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

模型組的精子活力、活率和曲線速度（VCL）、直線運動速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）、精子擺幅值（ALH）、運動直線性（LIN）、運動擺動性（WOB）、運動前向性（STR）等功能指標均明顯低于溶劑組;與模型組比較，艾煙的干預可以明顯改善弱精子癥模型大鼠的精子活力、活率和VCL、VSL、VAP、ALH、LIN、WOB、STR等功能指標，且與溶劑組比較無顯著差別;香煙組的精子活力、活率和VCL、VSL、VAP、ALH、LIN、WOB等功能指標均顯著低于溶劑組和艾煙組，且與模型組差異無統(tǒng)計學意義;各組大鼠的精子密度沒有顯著變化。見表1、表2。

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計資料顯示，全世界范圍內(nèi)不育癥的發(fā)生率約占育齡夫婦的20%[8]，其中男性不育占40% ～60%[8]，由于精子活力的降低而導致的男性不育約30%[9]。計算機輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）通過計算機視頻技術(shù)與顯微鏡進行連接，跟蹤拍攝和記錄精子的運動軌跡并進行動態(tài)分析處理，從而鑒定精液質(zhì)量[10]。本研究使用計算機輔助精子分析系統(tǒng)來檢測艾煙和香煙煙霧對弱精子癥模型大鼠附睪的精子質(zhì)量和運動能力的影響。

針灸療法作為中醫(yī)藥治療系統(tǒng)的重要組成部分，對于男性弱精子癥有一定的治療作用[11]。許多醫(yī)家運用艾灸溫補肝腎、活血通脈的功效治療男科疾病，也有醫(yī)家針對腎陽虛患者采取辨證施治，著重使用灸法治療[12]。臨床研究表明，艾灸治療男性疾病有顯著的療效，其治愈率和整體有效率明顯優(yōu)于單純西藥或單純針刺[12]。艾灸的治療效果是一種綜合的效應(yīng)，其中艾燃燒產(chǎn)物的組成和功用對于艾灸發(fā)揮其治療效果至關(guān)重要[13]。古人認為艾煙本身具有一定的藥效，并有將艾葉做成卷后點燃，口吸艾煙治療咳嗽，鼻吸艾煙治療牙痛，熏艾治療痢疾、瘡口不愈的記載?，F(xiàn)代研究顯示，艾燃燒生成物具有殺菌抗病毒[14]，調(diào)節(jié)免疫[15]，清除自由基、抗氧化[16]，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[17]，減輕炎性反應(yīng)[18]等作用。

吸煙可對人體造成多種危害，也被認為是弱精子癥的風險因素之一。香煙中的尼古丁、焦油、一氧化碳、鎘等有害物質(zhì)會以多種方式影響男性的生殖功能[19]。艾煙具有與香煙類似的物理特性，并且以相似的方式進入人體，但兩者是完全不同的物質(zhì)，對機體有不同的影響[20]。艾煙對弱精子癥模型大鼠精子質(zhì)量的影響尚未見到文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)，艾煙能夠顯著提高弱精子癥模型大鼠的精子活力、活率和運動能力，從而起到一定的改善精子質(zhì)量的作用。為證實艾煙與香煙煙霧產(chǎn)生的效應(yīng)不同，我們設(shè)置香煙組作為對照，結(jié)果表明，在弱精子癥模型中，香煙煙霧對于精子質(zhì)量的影響與模型組差異無統(tǒng)計學意義。

研究證實，機體產(chǎn)生過量的ROS是男性弱精子癥發(fā)生的重要病因之一。前期動物實驗表明，艾煙能夠抑制機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化的作用[16，21]。結(jié)合本研究的實驗結(jié)果，我們認為艾煙是艾灸療法的起效因素之一，它可能通過抑制生殖系統(tǒng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)來改善精子的活力和運動能力。

參考文獻

[1] Cooper TG，Noonan E，von Eckardstein S，et al.World Health Organization reference values for human semen characteristics[J].Hum Reprod Update，2010，16（3）：231-245.

[2]Sakagami H，Matsumoto H，Satoh K，et al.Cytotoxicity and radical modulating activity of Moxa smoke[J].In Vivo，2005，19（2）：391-397.

[3]Lei W，Li H，Ping L，et al.Moxa smoke：Is it a beneficial or hazardous factor for infertility？A preclinical study on sperm parameters and sex hormones in male rats[J].Euro J Integ Med，2016，8（1）：28-35.

[4]Oberlnder G，Yeung CH，Cooper TG.Induction of reversible infertility in male rats by oral ornidazole and its effects on sperm motility and epididymal secretions[J].J Reprod Fertil，1994，100（2）：551-559.

[5]金滋潤，柳博珩，蔡捷，等.電針治療大鼠弱精子癥的實驗研究[J].針刺研究，2017，42（2）：114-118.

[6]哈略，崔瑩雪，林瑤，等.艾灸及艾煙對APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2019，34（7）：3197-3200.

[7]王世平，呂魏峰，孫秀斌，等.生精散對大鼠精子特異性鈣通道的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（6）：1692-1695.

[8]Camargo M，Intasqui P，de Lima CB，et al.Maldi-tof fingerprinting of seminal plasma lipids in the study of human male infertility[J].Lipids，2014，49（9）：943-956.

[9]Rowe PJ，Comhaire FH.WHO manual for the standardized investigation，diagnosis and management of the infertile male[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：1.

[10] 胡庭溪，朱化彬，杜衛(wèi)華.計算機輔助精子分析系統(tǒng)的研究進展[J].中國畜牧雜志，2014，50（21）：73-77.

[11]Crimmel AS，Conner CS，Monga M.Withered Yang：a review of traditional Chinese medical treatment of male infertility and erectile dysfunction[J].J Androl，2001，22（2）：173-182.

[12]豐曉溟，趙天平，崔云華，等.灸法治療男科常見病研究進展[J].針灸推拿醫(yī)學：英文版，2012，10（3）：185-190.

[13]何瑩瑩，王紅霞，劉曉輝，等.中醫(yī)外治對脾胃虛寒型胃脘痛患者鎮(zhèn)痛效果的影響[J].中國藥物經(jīng)濟學，2017，12（6）：52-54.

[14]魏孜孜，盧標清，孫一帆.三種外治方法治療耳真菌病的臨床觀察[J].中國醫(yī)藥導報，2010，7（2）：35-36，38.

[15] 王昊，楊佳，趙百孝，等.艾燃燒生成物對ApoE基因敲除小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、GABA的影響[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（8）：1410-1413.

[16]黃暢，崔瑩雪，劉鈞天，等.艾灸及艾煙對載脂蛋白E基因敲除小鼠血清MDA、SOD水平的影響[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（8）：1407-1409.

[17]于夢蕓，哈略，黃暢，等.艾灸對ApoE～（-/-）動脈粥樣硬化小鼠肝臟病理及脂質(zhì)代謝的作用研究[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（8）：1419-1423.

[18]哈略，趙百孝.艾灸對動脈粥樣硬化小鼠炎性反應(yīng)因子及MMP-9的實驗研究[J].世界中醫(yī)藥，2016，11（8）：1389-1394.

[19]孫啟玉，李劍，韓迎春，等.吸煙對男性精液質(zhì)量、精漿活性氧及精子凋亡率的影響[J].中國實驗診斷學，2011，15（6）：1046-1048.

[20]韓麗.艾煙的毒理學實驗研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2013.

[21]孟笑男，徐煥芳，崔瑩雪，等.艾燃燒生成物對快速老化模型小鼠大腦SOD、MDA和GSH-Px的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2011，4（6）：413-415.

（2019-06-17收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81574068，81874503）作者簡介：劉雅潔（1992.11—），女，碩士研究生，研究方向：灸法的作用原理，E-mail：lyj2287@163.com通信作者：趙百孝（1963.03—），男，博士，教授，博士研究生導師，研究方向：灸法的作用原理，E-mail：baixiao100@vip.sina.com