鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的體外抑菌作用及機(jī)制研究

閆莉　周曉英

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）05-0607-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.05.20

摘 要 目的：研究鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的體外抑菌作用及可能機(jī)制，為其防治齲病的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：以復(fù)方氯己定含漱液為陽(yáng)性對(duì)照、5%二甲基亞砜（DMSO）溶液為陰性對(duì)照，采用打孔法抑菌試驗(yàn)測(cè)定抑菌圈直徑考察50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/mL鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果，并采用微量稀釋法測(cè)定其對(duì)變異鏈球菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。以5%DMSO溶液為陰性對(duì)照，采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC鞣花酸對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響，并在熒光染色后通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察1/2MIC鞣花酸作用后生物膜的結(jié)構(gòu)變化;分別采用苯酚硫酸法和還原型輔酶Ⅰ氧化法考察1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC鞣花酸對(duì)變異鏈球菌細(xì)胞外多糖（EPS）的抑制率和細(xì)胞外基質(zhì)中乳酸脫氫酶（LDH）活力的影響。結(jié)果：12.5～50 mg/mL鞣花酸對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)生了直徑均大于15 mm的抑菌圈，50 mg/mL鞣花酸作用下抑菌圈直徑與復(fù)方氯己定含漱液相當(dāng)。鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的MIC、MBC分別為12.5、25 mg/mL。1/8MIC～MIC鞣花酸作用后細(xì)菌生物膜的存活率較陰性對(duì)照顯著降低（P<0.01），且呈劑量依賴趨勢(shì)，MIC鞣花酸作用后細(xì)菌生物膜的存活率僅為（16.41±1.346）%;熒光染色后顯微鏡下可見，1/2MIC鞣花酸作用后細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)被破壞;1/8MIC～MIC鞣花酸作用后細(xì)菌水不溶性EPS和水溶性EPS的抑制率較陰性對(duì)照均顯著升高（P<0.01），1/4MIC～MIC鞣花酸作用后細(xì)胞外基質(zhì)中LDH活力較陰性對(duì)照均顯著升高（P<0.01），且呈劑量依賴趨勢(shì)。結(jié)論：鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用;其機(jī)制可能與抑制EPS產(chǎn)生、降低細(xì)菌的黏附、破壞細(xì)菌細(xì)胞膜有關(guān)。

關(guān)鍵詞 鞣花酸;變異鏈球菌;細(xì)菌生物膜;體外;抑菌作用;機(jī)制

Study on in vitro Anti-bacterial Activity and Mechanism of Ellagic Acid on Streptococcus mutans

YAN Li1，ZHOU Xiaoying2（1.Central Laboratory， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China;2.School of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the in vitro anti-bacterial activity and potential mechanism of ellagic acid on Streptococcus mutans， and to provide evidence for its prevention and treatment of dental caries. METHODS： Using Compound chlorhexidine gargle as positive control， 5%DMSO as negative control， bacteriostasis experiment was conducted by the method of drilling hole， and bacteriostatic effects of 50， 25， 12.5， 6.25， 3.125， 1.562 5 mg/mL ellagic acid on S. mutans was preliminarily determined by measuring the diameter of bacteriostatic ring. The minimal inhibitory concentration （MIC） and minimal bactericidal concentration （MBC） of ellagic acid on S. mutans were determined by microdilution method. Using 5% DMSO as negative control， the effects of 1/8 MIC， 1/4 MIC， 1/2 MIC and MIC ellagic acid on the formation of S. mutans biomembrane was determined by crystal violet staining. The changes of the biomembrane structure under the action of 1/2 MIC ellagic acid were observed by microscopy after fluorescence staining. Phenol sulfuric acid method and reducing coenzymeⅠoxidation method were used to determine inhibitory effects of 1/8MIC， 1/4MIC， 1/2MIC， MIC ellagic acid on S. mutans on extracellular polysaccharide （EPS） as well as effect on the activity of lactate dehydrogenase （LDH） in extracellular matrix. RESULTS： Ellagic acid with concentration of 12.5～50 mg/mL produced an inhibitory ring on S. mutans with diameter greater than 15 mm. Under the action of 50 mg/mL ellagic acid， the diameter of bacteriostatic ring was the same as that of Compound chlorhexidine gargle. MIC and MBC of ellagic acid to S. mutans were 12.5 mg/mL and 25 mg/mL. The survival rate of bacterial biomembrane after 1/8MIC-MIC ellagic acid treatment was significantly lower than that of the negative control （P<0.01）， and had a certain dose-response trend. After MIC ellagic acid treatment， the survival rate of bacterial biomembrane was （16.41±1.346）%. After fluorescence staining， the structure of bacterial biomembrane was destroyed by 1/2 MIC ellagic acid. After treated with 1/8MIC-MIC ellagic acid， its inhibitory rates on water-soluble EPS and water-insoluble EPS were increased significantly， compared with negative control （P<0.01）. After treated with 1/4MIC-MIC ellagic acid， the activity of LDH in the extracellular matrix of bacteria increased significantly， compared with negative control （P<0.01）， in dose-effect dependent trend. CONCLUSIONS： Ellagic acid can inhibit the growth of S. mutans， the mechanism of which may be associated with inhibiting EPS production， reducing bacterial adhesion， destroying bacterial cell membrane.

KEYWORDS? ?Ellagic acid; Streptococcus mutans; Biomem- brane; in vitro; Anti-bacterial activity; Mechanism

齲病是一種口腔內(nèi)多因素疾病，與心血管疾病、癌癥一起被列為人類三大重點(diǎn)防治的慢性非傳染性疾病[1]。雖然齲病的病程發(fā)展較為緩慢，但是其發(fā)病率高、流行區(qū)域廣泛，不容忽視。細(xì)菌的存在是齲病發(fā)生的基礎(chǔ)，而牙菌斑生物膜是齲病發(fā)生所依賴的微環(huán)境[2]。變異鏈球菌是目前公認(rèn)的主要致齲菌群，常黏附于牙面形成生物膜而導(dǎo)致齲病[3]。糖代謝是變異鏈球菌致齲的重要途徑：變異鏈球菌以蔗糖為底物，可以合成細(xì)菌胞外多糖（EPS），而合成EPS和形成生物膜的能力是其經(jīng)典毒力表型，這些毒力因子在變異鏈球菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。

目前，抗生素、氟化物以及免疫防齲等的使用已被證明能有效地抑制口腔內(nèi)的致齲菌，但這些方法存在會(huì)產(chǎn)生耐藥性或致使口腔菌群失調(diào)等問(wèn)題[5]。而天然產(chǎn)物因其毒副作用小的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為防齲藥物研究開發(fā)的熱點(diǎn)[6]。鞣花酸作為一種多酚二內(nèi)酯成分，是沒(méi)食子酸的二聚衍生物，存在于許多水果（如覆盆子、石榴等）及藥用植物（如五倍子、地榆等）中[7]。鞣花酸因具有多種生物活性（如抗氧化、抗癌、抗突變、抑制潰瘍、抑制人體免疫缺陷病毒等）而受到廣泛關(guān)注[8-9]。近年來(lái)，許多多酚類化合物（如茶多酚、厚樸酚等）被證實(shí)具有廣譜的抑菌效果，且對(duì)口腔致齲菌有良好的抑制作用[10]。鞣花酸作為一種天然的多酚類成分，國(guó)內(nèi)外對(duì)其抑菌作用，特別是其對(duì)口腔致齲菌的抑制作用及機(jī)制的研究報(bào)道相對(duì)較少。因此，本研究以鞣花酸為研究對(duì)象，通過(guò)考察對(duì)口腔主要致齲菌——變異鏈球菌的生長(zhǎng)、細(xì)菌生物膜形成等毒力因子的影響，探索其在防治齲病方面的開發(fā)應(yīng)用潛力。

1 材料

1.1 儀器

C2型激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）;311型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）;752型紫外分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）;4K15型冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）;LDZX-75KBS型高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司）;SMP500型酶標(biāo)儀（德國(guó)Spectro Max公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方氯己定含漱液（江蘇晨牌邦德藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201810232，規(guī)格：500 mL，含葡萄糖酸氯己定0.6 g、甲硝唑0.1 g）;鞣花酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111959-201802，純度：≥98%）;腦心浸肉湯（BHI）培養(yǎng)基（批號(hào)：1226L031）、刃天青染色劑（批號(hào)：512C031）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;活/死細(xì)菌染色試劑盒（貨號(hào)：L13152）、磷酸鹽緩沖液 （PBS，批號(hào)：NXL0739）均購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司;乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（中國(guó)南京建成生物工程公司，批號(hào)：20181025）;其余試劑均為分析純，水為滅菌蒸餾水。

1.3 菌種

變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 700610）由新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 菌懸液的制備

取常規(guī)復(fù)蘇的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取菌液在BHI板上劃線培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落在BHI液體培養(yǎng)基中以同樣條件純培養(yǎng)。待細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用紫外分光光度計(jì)調(diào)整菌液濃度約107 CFU/mL[在630 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）為0.2]，備用。

2.2 抑菌圈的測(cè)定

采用打孔法抑菌試驗(yàn)進(jìn)行抑菌圈測(cè)定。將鞣花酸對(duì)照品用5%二甲基亞砜（DMSO）溶液溶解后制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的母液;再用BHI液體培養(yǎng)基將母液按二倍稀釋法稀釋成鞣花酸質(zhì)量濃度分別為25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/mL的藥液。取100 μL菌懸液（107 CFU/mL，下同）均勻涂布在BHI平板上，再以打孔器打孔。設(shè)置鞣花酸不同質(zhì)量濃度組（1.562 6～50? ? mg/mL）、陰性對(duì)照組（5%DMSO）和陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方氯己定含漱液），每組重復(fù)設(shè)置3個(gè)孔，每孔中加入20 μL相應(yīng)樣品溶液，然后于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出后，以十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑，取平均值。結(jié)果判定按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)[11]：抑菌圈直徑<10 mm為無(wú)抑菌活性，10 mm為輕度敏感，11～15 mm為中度敏感，16～20 mm為高度敏感。

2.3 最小抑菌濃度的測(cè)定

使用96孔板，按100 μL/孔加入菌懸液，設(shè)置鞣花酸不同質(zhì)量濃度組（50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/mL）、陰性對(duì)照組（5%DMSO溶液）和陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方氯己定含漱液），每組重復(fù)設(shè)置3個(gè)孔。每孔中加入100 μL相應(yīng)樣品溶液，然后37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔中加入刃天青染色劑（1 mg/mL）20 μL，4 h后觀察，由藍(lán)色變?yōu)榉凵乃幬餄舛燃礊樽钚∫志鷿舛龋∕IC）。

2.4 最小殺菌濃度的測(cè)定

根據(jù)MIC值測(cè)定結(jié)果，選擇藥液濃度≥MIC的各孔菌懸液，分別劃線于BHI平板上，將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察無(wú)可見菌落生長(zhǎng)的最低濃度即為最小殺菌濃度（MBC）。

2.5 變異鏈球菌細(xì)菌生物膜形成情況考察

采用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行測(cè)定。使用96孔板，按100 μL/孔加入菌懸液，設(shè)置鞣花酸不同質(zhì)量濃度組（1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC）、陰性對(duì)照組（5%DMSO溶液），每組重復(fù)設(shè)置3個(gè)孔，每孔加入100 μL相應(yīng)樣品溶液，然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液。沉淀用無(wú)菌PBS輕輕洗滌2次，加入100 μL 0.1%結(jié)晶紫，對(duì)形成的生物膜染色15 min。棄去染料，用無(wú)菌PBS沖洗2次，干燥后每孔加入100 μL 95%乙醇溶液，溶解已被染色的生物膜上的結(jié)晶紫。采用酶標(biāo)儀于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，并計(jì)算細(xì)菌生物膜存活率：細(xì)菌生物膜存活率（%）=1-[（1-OD給藥組/OD陰性對(duì)照組）×100%]。

2.6 變異鏈球菌細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的觀察

采用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。按500? ? ? ?μL/皿的量將菌懸液加入激光掃描共聚焦專用培養(yǎng)皿中，設(shè)置鞣花酸組（1/2MIC）和陰性對(duì)照組（5%DMSO溶液），每組設(shè)置3個(gè)平行皿，每皿加入500 μL相應(yīng)樣品溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，以無(wú)菌PBS洗去浮菌，用2%甲基纖維素固定后，加入制備好的活/死細(xì)菌熒光染料20 μL[按說(shuō)明書將試劑盒中熒光染色劑SYTO9和碘化丙啶（PI）按照 1 ∶ 1（V/V）的比例混合溶于適當(dāng)體積的無(wú)菌水中]，室溫下避光孵育20 min，然后立即在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。活菌被SYTO9染色后發(fā)出綠色熒光，死菌被PI染色后發(fā)出紅色熒光，SYTO9和PI染色疊加圖中黃色表示活菌和死菌重疊處。

2.7 變異鏈球菌中EPS生成情況考察

采用苯酚硫酸法進(jìn)行測(cè)定。按500 μL/管的量將菌懸液加入無(wú)菌離心管中，以5%DMSO溶液為陰性對(duì)照，考察不同質(zhì)量濃度（1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC）鞣花酸對(duì)變異鏈球菌中EPS生成的影響，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行管，每管中加入5 mL相應(yīng)樣品溶液，然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。在4 ℃條件下以5 000 r/min離心20 min（下同），收集上清液;用無(wú)菌蒸餾水重懸沉淀并再次離心，收集上清液，合并2次上清液（含有水溶性EPS）。然后加入0.1 mol/L NaOH溶液5 mL重懸沉淀，離心2次，收集上清液（含有水不溶性EPS）。以0.22 μm的濾膜分別過(guò)濾以上2種上清液，各取適量分別加入3倍量冷卻的95%乙醇溶液，4 ℃過(guò)夜以沉淀EPS。次日再次離心，棄水相，沉淀物分別加入5 mL蒸餾水和5 mL 0.1 mol/L NaOH 溶液溶解。取上述含2種EPS的溶液各1 mL，分別加入5%冰苯酚1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置5 min后，放入沸水浴中反應(yīng)15 min后，冷卻到室溫。采用紫外分光光度儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，并分別計(jì)算水溶性EPS和水不溶性EPS的抑制率：EPS抑制率（%）=（1-OD給藥組/OD陰性對(duì)照組）×100%。

2.8 變異鏈球菌細(xì)胞外基質(zhì)中LDH活力的測(cè)定

采用還原型輔酶Ⅰ氧化法進(jìn)行測(cè)定。使用96孔板，按100 μL/孔加入菌懸液和等量的BHI液體培養(yǎng)基后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去上清液，沉淀用無(wú)菌PBS緩沖液清洗2次。設(shè)置鞣花酸不同質(zhì)量濃度組（1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC）和陰性對(duì)照組（5%DMSO溶液），每組設(shè)置3個(gè)平行孔，在清洗過(guò)的培養(yǎng)孔（含有沉淀）中加入200 μL相應(yīng)樣品溶液后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。離心，收集上清液，按照LDH試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定LDH活力。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析的Dunnett（雙側(cè)）檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 抑菌圈測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，5%DMSO作為溶劑對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯變化。12.5～50 mg/mL鞣花酸對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)生了抑菌圈，且抑菌圈的直徑隨著藥物質(zhì)量濃度的增加而增大，其中50 mg/mL鞣花酸對(duì)變異鏈球菌抑菌圈的大小與復(fù)方氯己定含漱液相近，對(duì)變異鏈球菌均為高度敏感。抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果（x±s，n=3，mm）

3.2 MIC和MBC測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的MIC為12.5? ? mg/mL、MBC為25 mg/mL，表明鞣花酸對(duì)變異鏈球菌有抑制作用。

3.3 細(xì)菌生物膜存活率的測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度鞣花酸作用后，變異鏈球菌生物膜存活率較陰性對(duì)照組均顯著降低（P<0.01），且呈明顯劑量依賴趨勢(shì)。在MIC濃度下，變異鏈球菌生物膜的存活率僅為（16.41±1.346）%。細(xì)菌生物膜存活率測(cè)定結(jié)果見圖1。

3.4 細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果

染色結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組中細(xì)胞互相黏附聚集形成團(tuán)塊，主要呈綠色熒光，表示多為活菌，細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)完整。鞣花酸組中，多呈紅色熒光，表明經(jīng)1/2MIC鞣花酸干預(yù)后細(xì)胞多為死菌，生物膜結(jié)構(gòu)被破壞。變異鏈球菌生物膜激光共聚焦掃描圖見圖2。

3.5 細(xì)菌中EPS生成抑制率測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，鞣花酸對(duì)變異鏈球菌中水不溶性EPS和水溶性EPS的生成均有顯著抑制作用，不同質(zhì)量濃度鞣花酸對(duì)2種多糖的生成抑制率均較陰性對(duì)照顯著升高（P<0.01），且該抑制作用隨著鞣花酸質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，但鞣花酸對(duì)變異鏈球菌水不溶性EPS的抑制作用強(qiáng)于其對(duì)水溶性EPS的抑制作用。EPS的生成抑制率測(cè)定結(jié)果見圖3。

3.6 細(xì)菌細(xì)胞外基質(zhì)中LDH活力的測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度鞣花酸作用后，細(xì)菌細(xì)胞外基質(zhì)中LDH活力均有所提高，且呈劑量依賴趨勢(shì)。與陰性對(duì)照組比較， 1/4MIC、1/2MIC、MIC鞣花酸組細(xì)菌細(xì)胞外基質(zhì)中LDH活力均顯著升高（P<0.01）。LDH活力測(cè)定結(jié)果見圖4。

4 討論

齲病是口腔內(nèi)的慢性多因素疾病，尋找安全、有效、經(jīng)濟(jì)的防齲藥品一直是齲病防治研究的重點(diǎn)[12]。天然藥物因其毒副作用小、取材方便和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，在齲病防治中的作用日益受到重視[13]。細(xì)菌的存在是齲病發(fā)生的第一要素，細(xì)菌在口腔中的存在形式主要為生物膜狀態(tài)，當(dāng)浮游細(xì)菌黏附團(tuán)聚形成生物膜后，能快速適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境，這種由細(xì)菌和基質(zhì)搭建的緊密生物膜結(jié)構(gòu)，成為了阻礙藥物穿透的有力屏障[14]。在這種狀態(tài)下，生物膜結(jié)構(gòu)的細(xì)菌比浮游狀態(tài)下的同種細(xì)菌耐藥性更強(qiáng)，并且其致毒力和對(duì)抗宿主免疫防御的能力也更強(qiáng)[15]。因此，在研究中除了研究浮游狀態(tài)下細(xì)菌的生長(zhǎng)變化外，對(duì)于生物膜狀態(tài)下細(xì)菌的生長(zhǎng)、代謝的研究顯得更加重要。EPS是細(xì)菌以蔗糖為底物分泌出的緊密圍繞菌體細(xì)胞的莢膜或者黏質(zhì)層，可以參與生物膜的基質(zhì)組成。其中，水不溶性EPS能夠促進(jìn)細(xì)菌的蔗糖依賴性細(xì)胞黏附，加快生物膜的形成和齲病的發(fā)展;并且，其還具有生物屏障作用，可以限制生物膜內(nèi)外各種物質(zhì)的出入[16]。水溶性EPS是細(xì)菌在生物膜內(nèi)的能量補(bǔ)充劑，在外源性糖缺乏時(shí)，其可以降解成單糖而提供能量[6]。LDH以高濃度存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，是變異鏈球菌中的固有酶，可以調(diào)節(jié)細(xì)菌的酸代謝[17]。由于LDH主要存在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，故可以通過(guò)測(cè)定細(xì)胞外基質(zhì)中LDH活力來(lái)判定藥物對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的影響[18]，從而推測(cè)藥物可能的抑菌機(jī)制。因此，關(guān)于藥物對(duì)口腔內(nèi)致齲細(xì)菌的作用研究需要從藥物對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)、生物膜的形成、代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)、胞外基質(zhì)的影響等多方面進(jìn)行。

本研究通過(guò)打孔法抑菌圈試驗(yàn)測(cè)定抑菌圈直徑，來(lái)初步判定鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的抑制作用。結(jié)果顯示，12.5～50 mg/mL鞣花酸對(duì)變異鏈球菌產(chǎn)生了抑菌圈，且抑菌圈直徑>15 mm。研究中選用復(fù)方氯己定含漱液為陽(yáng)性對(duì)照藥，該藥品中每500 mL中含葡萄糖酸氯己定0.6 g、甲硝唑0.1 g，為口腔常用的抑菌消炎藥[19]。本研究選用微量稀釋法測(cè)定了鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的MIC，試驗(yàn)中以刃天青顯色進(jìn)行MIC的終點(diǎn)判定，最終得到了鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的MIC、MBC分別為12.5、25 mg/mL，該方法比直接觀察法更加客觀、靈敏。另外，試驗(yàn)結(jié)果顯示，3.125～25 mg/mL鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的生物膜產(chǎn)生了抑制作用，且1/2MIC濃度的鞣花酸可破壞細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)。通過(guò)以上試驗(yàn)結(jié)果可知，鞣花酸不僅可以抑制浮游細(xì)菌的生長(zhǎng)，還能抑制細(xì)菌生物膜的形成。

除此之外，本研究還對(duì)鞣花酸的抑菌機(jī)制進(jìn)行了研究。以1/4MIC～MIC濃度鞣花酸作用后，細(xì)菌胞外基質(zhì)中LDH的活力顯著升高（P<0.01）。通過(guò)對(duì)藥物作用后細(xì)菌中EPS進(jìn)行收集測(cè)定，發(fā)現(xiàn)鞣花酸對(duì)變異鏈球菌水不溶性EPS和水溶性EPS均有不同程度的抑制作用。通過(guò)以上研究可知，鞣花酸可以阻斷細(xì)菌毒力因子的作用途徑：第一，其可以通過(guò)抑制EPS的形成能力以降低細(xì)菌的黏附、聚集及能源供給，干擾細(xì)菌內(nèi)正常的糖代謝，從而影響細(xì)菌生物膜的形成;第二，其還可以通過(guò)對(duì)變異鏈球菌的細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的膜損傷，使存在于細(xì)菌胞漿內(nèi)的LDH從胞漿中釋放出來(lái)，破壞細(xì)胞的正常形態(tài)和物質(zhì)交換從而降低細(xì)菌活性。另外，在測(cè)定鞣花酸對(duì)EPS的抑制率時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)其對(duì)水不溶性EPS的抑制率較對(duì)水溶性EPS的高，可能是因?yàn)樗蝗苄訣PS具有高穩(wěn)定性、強(qiáng)黏性、不易被降解的特性，同時(shí)也是細(xì)菌具有更強(qiáng)致齲性的原因之一[20]，因此更加說(shuō)明鞣花酸能通過(guò)干擾EPS途徑抑制細(xì)菌生物膜的形成。

綜上，鞣花酸對(duì)變異鏈球菌的生長(zhǎng)以及生物膜的形成均有抑制作用。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制EPS產(chǎn)生、降低細(xì)菌的黏附、破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，從而降低細(xì)菌活性。本研究為將鞣花酸開發(fā)成天然的防治齲病藥物提供了一定的實(shí)驗(yàn)參考，但其更深入的抑菌作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-11-05 修回日期：2020-01-17）

（編輯：林 靜）