HPLC法測定圣愈湯凍干粉中4個指標成分的含量

董丹華　劉玉軍　李亞男　胡祥昊　孫平　李婷　劉菊妍　高鵬

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）05-0576-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.05.14

摘 要 目的：建立測定圣愈湯凍干粉中阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯、黃芪甲苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法測定3批凍干粉樣品4種成分含量。測定阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯的色譜柱為Inertsil ODS-SP C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為330 nm，檢測器為二極管陣列檢測器，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL;測定黃芪甲苷的色譜柱為Kromasil C18，流動相為乙腈-水（32 ∶ 68，V/V），檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度為100 ℃，載氣（空氣）流量為2.5 L/min，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯和黃芪甲苷進樣量線性范圍分別為0.050 15～10.03 μg（r=0.999 8）、0.067 80～13.56 μg（r=0.999 9）、0.057 30～11.46 μg（r=0.999 5）、1.128～11.28 μg（r= 0.999 3）;檢測限分別為2.12×10-4、1.30×10-3、8.02×10-4、1.09×10-3 μg，定量限分別為7.43×10-4、3.87×10-3、2.34×10-3、3.36×10-3? ? ?μg;精密度、穩(wěn)定性（12 h）、重復性試驗的RSD均小于2%（n=6）;平均加樣回收率分別為99.6%（RSD=0.83%，n=6）、100.9%（RSD=1.07%，n=6）、98.8%（RSD=0.84%，n=6）和101.3%（RSD=0.99%，n=6）。3批樣品中阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯和黃芪甲苷的含量分別為1.225～1.248、0.413～0.424、0.325～0.332、0.394～0.404 mg/g（批間RSD<1.5%）。結(jié)論：建立的含量測定方法穩(wěn)定性、重復性好，能夠快速、準確地測定圣愈湯凍干粉中阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯和黃芪甲苷的含量。

關(guān)鍵詞 圣愈湯;凍干粉;高效液相色譜法;阿魏酸;毛蕊花糖苷;藁本內(nèi)酯;黃芪甲苷;含量測定

Content Determination of 4 Indicator Components in Shengyu Decoction Lyophilized Powder by HPLC

DONG Danhua1，LIU Yujun2，LI Yanan1，HU Xianghao1，SUN Ping1，LI Ting3，LIU Juyan4，GAO Peng1（1.School of Pharmacy， Shandong University of TCM， Jinan 250355， China;2.Chinese Pharmacy of Qihe County Peoples Hospital of Shandong Province， Shandong Dezhou 251100， China;3.Dept. of Pharmacy， Wendeng Osteopathic Hospital of Shandong Province， Shandong Weihai 264400， China;4.Dept. of Technology， Guangzhou Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Guangzhou 510130， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the content determination method of ferulic acid， verbascoside， ligustilide and astragaloside in Shengyu decoction lyophilized powder. METHODS： HPLC method was adopted to determine 4 components in 3 batches of lyophilized powder. The determination of ferulic acid， verbascoside and ligustilide was performed on Inertsil ODS-SP C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min; detector was diode array detector; detection wavelength was set at 330 nm; column temperature was 30 ℃， the sample size was 10 μL. The determination of astragaloside was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （32 ∶ 68， V/V）; detector was evaporative light scattering detector; the drift tube temperature was 100 ℃， the carrier gas （air） flow rate was 2.5 L/min at the flow rate of 1.0 mL/min; column temperature was 30 ℃， the sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of ferulic acid， verbascoside， ligustilide and astragaloside were 0.050 15-10.03 μg （r=0.999 8）， 0.067 80-13.56 μg （r=0.999 9）， 0.057 30-11.46 μg （r=0.999 5）， 1.128-11.28 μg （r=0.999 3）， respectively. The detection limits were 2.12×10-4， 1.30×10-3， 8.02×10-4， 1.09×10-3 μg， respectively. The limit of quantification were 7.43×10-4， 3.87×10-3， 2.34×10-3， 3.36×10-3 μg， respectively. RSDs of precision， stability （12 h） and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6）. Average recovery rates were 99.6% （RSD=0.83%， n=6）， 100.9% （RSD=1.07%， n=6）， 98.8% （RSD=0.84%， n=6） and 101.3% （RSD=0.99%， n=6）， respectively. The contents of ferulic acid， verbascoside， ligustilide and astragaloside in 3 batches of samples were 1.225-1.248， 0.413-0.424， 0.325-0.332， 0.394-0.404 mg/g， respectively （RSDs among batches were lower than 1.5%）. CONCLUSIONS： Established method is stable， reproducible， rapid and accurate for the content determination of ferulic acid， verbascoside， ligustilide and astragaloside in Shengyu decoction lyophilized powder.

KEYWORDS? ?Shengyu decoction; Lyophilized powder; HPLC; Ferulic acid; Verbascoside; Ligustilide; Astragaloside; Content determination

圣愈湯為經(jīng)典名方，出自金代李東垣的《蘭室秘藏》：“治諸惡瘡，血出多而心煩不安，不得睡眠，亡血故也，以此藥主之”。此方由生地黃、熟地黃、川芎、人參各三分，當歸身、黃芪各五分組成。方中人參、黃芪補氣;當歸身、生熟地黃、川芎補血滋陰;配合成方，共奏補益氣血、活血止痛之效[1-3]。現(xiàn)代藥理研究表明，圣愈湯對血液系統(tǒng)具有抗凝作用[1]，可改善微循環(huán)、改善血液流變學、降血脂、抗動脈粥樣硬化[2]，還可治療氣血虛證痛經(jīng)[3]，同時對婦科惡性腫瘤并發(fā)的貧血癥狀也有改善效果[4]。圣愈湯中當歸和川芎可活血、補血，共有的成分阿魏酸和藁本內(nèi)酯為主要活性物質(zhì)[5-8];地黃可滋陰、補血，所含毛蕊花糖苷可促進血虛動物紅細胞及血紅蛋白的恢復[9];《本草綱目》中稱黃芪為“補藥之長”，其主要成分黃芪甲苷對心血管系統(tǒng)的作用效果顯著[10]。因此，阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯和黃芪甲苷這4個成分均為圣愈湯的重要指標成分。目前，2015年版《中國藥典》尚未收載圣愈湯相關(guān)制劑，數(shù)據(jù)庫中多收錄的是圣愈湯中醫(yī)辨證論治方面的內(nèi)容，尚未檢索到關(guān)于圣愈湯含量測定的研究報道。為了便于制劑保存及最大程度地保持中藥湯液的物質(zhì)一致性，可將圣愈湯采用減壓濃縮和冷凍干燥法制備成凍干粉，之后還可加入相應(yīng)輔料制劑開發(fā)成相關(guān)的成藥制劑。因此，本試驗將建立圣愈湯凍干粉中阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯和黃芪甲苷含量的測定方法，為后續(xù)的相關(guān)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030C型高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（DAD）、LabSolutions工作站（日本島津制作所）;3300型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD，美國奧泰科技有限公司）;XS105型分析天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司，感量：0.01 mg）;YP10002型電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司，感量：0.01 g）;KQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;H22-X3型電陶爐（九陽股份有限公司）;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;RE 5298A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

阿魏酸（批號：110773-201614，純度：99.0%）、毛蕊花糖苷（批號：111530-201713，純度：92.5%）、黃芪甲苷（批號：110781-201314，純度：95.8%）各對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院;藁本內(nèi)酯對照品（批號：58546-55，純度：98.0%）來源于上海雅吉生物科技有限公司;甲醇、磷酸均為色譜純;純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）;生地黃、熟地黃、當歸、川芎、人參、黃芪各飲片均經(jīng)山東中醫(yī)藥大學藥學院萬鵬教授鑒定為真品，具體信息見表1。

表1 中藥飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 凍干粉樣品制備

原方記載圣愈湯的制備方法為：“生地黃、熟地黃、川芎、人參各三分，當歸身、黃芪各五分，右[父]咀如麻豆大，都作一服，水二大盞，煎至一盞，去粗”[11]（“右[父]咀”指用牙齒將上述藥材嚼碎）。本試驗樣品制備方法如下：取已剪成麻豆粒大?。s為黃豆粒～5目大?。┑纳攸S、熟地黃、川芎、人參飲片各1.24 g，當歸身、黃芪飲片各2.06 g，置于砂鍋中，加水400 mL，稱質(zhì)量，置于電陶爐上，武火煎煮至沸騰，改用文火保持微沸，至總質(zhì)量減少200 g，停止加熱，趁熱用200目尼龍濾布濾過，擠壓藥渣，得到湯液;湯液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 ℃進行減壓濃縮，得到濃縮液;將濃縮液置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥，得到圣愈湯凍干粉。按上述方法制備3批成方凍干粉，批號分別為190615、190616、190617，質(zhì)量分別為4.92、5.14、5.07 g。另同法制備陰性樣品：取已剪成麻豆粒大小的人參飲片1.24 g、黃芪飲片2.06 g，按上述樣品制備方法制備，得到缺生地黃、熟地黃、川芎和當歸的陰性凍干粉A，平行3份，混勻，總質(zhì)量為2.5 g;取已剪成麻豆粒大小的生地黃、熟地黃、川芎、人參飲片各1.24 g，當歸身飲片2.06 g，按上述樣品制備方法制備，得到缺黃芪的陰性凍干粉B，平行3份，混勻，總質(zhì)量為11.4 g。

2.2 阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯含量測定方法建立

2.2.1 色譜條件 在文獻[12-13]基礎(chǔ)上設(shè)置本文條件。色譜柱為Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5? ? μm）;流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），采用梯度洗脫（0～8 min，5%A;8～55 min，5%A→27%A;55～57 min，27%A→73%A;57～60 min，73%A→5%A）;流速為1.0 mL/min;檢測器為DAD，檢測波長為330 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液制備。取阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯對照品，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸1.356 mg、毛蕊花糖苷1.003 mg和藁本內(nèi)酯1.146 mg的混合對照品貯備液;將貯備液以甲醇稀釋100倍，得到每1 mL含阿魏酸13.56 μg、毛蕊花糖苷10.03 μg和藁本內(nèi)酯11.46 μg的混合對照品溶液。（2）供試品溶液制備。取成方凍干粉（批號：190615）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同），放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）陰性樣品溶液A制備。取陰性凍干粉A約0.2 g，按上述供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別取“2.2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液A，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，各峰間分離度均大于1.5，其他成分對待測成分的測定無干擾，理論板數(shù)以阿魏酸峰計不低于3 000，色譜圖見圖1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品貯備液0.05、1、2、3、5 mL，置于不同10 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋制得 5 個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。取“2.2.2”項下混合對照貯備溶液及上述5個質(zhì)量濃度混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以進樣量為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）分別繪制各成分標準曲線，計算其回歸方程。結(jié)果，各成分在各自進樣量范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好，詳見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 檢測限與定量限考察 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，加甲醇倍比稀釋后，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限;當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限，結(jié)果見表2。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下混合對照溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖。結(jié)果，阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.52%、0.98%、0.75%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：190615），分別于室溫條件下放置0、2、5、8、10、12 h時，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為1.02%、0.47%、0.72%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復性試驗 取同一批凍干粉樣品（批號：190615）6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算各成分含量。結(jié)果，阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯平均含量分別為1.246、0.414、0.324 mg/g，RSD分別為0.96%、0.61%、0.55%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取凍干粉樣品（批號：190615）6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，各加入待測成分對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算各成分的加樣回收率。結(jié)果，阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯平均加樣回收率分別為99.6%（RSD=0.83%，n=6）、100.9%（RSD=1.07%，n=6）和98.8%（RSD=0.84%，n=6），詳見表3。

表3 阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.3 黃芪甲苷含量測定方法建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈-水（32 ∶ 68，V/V）;檢測器為ELSD，漂移管溫度為100 ℃;載氣（空氣）流量為2.5? ? ?L/min;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為10? ? ? ?μL[14]。

2.3.2 溶液的制備 （1）對照品溶液制備。稱取黃芪甲苷對照品適量，用甲醇溶解制成每1 ml含黃芪甲苷5.642 mg的對照品貯備液;將該貯備液加甲醇稀釋10倍，得到質(zhì)量濃度為564.2 μg/mL的對照品溶液。（2）供試品溶液制備。取凍干粉約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過;精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加水15 mL使溶解;用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25 mL;合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 mL;棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）陰性樣品溶液B制備。取陰性凍干粉B約1.0 g，按上述供試品溶液制備方法制備，即得[15]。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別取“2.3.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液B，按“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，黃芪甲苷與相鄰峰間分離度均大于1.5，其他成分對待測成分的測定無干擾，理論板數(shù)以黃芪甲苷計不低于? ?4 000，色譜圖見圖2。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3.2”項下對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.7、1 mL，置于不同5 mL量瓶中，加甲醇制成6個不同濃度的對照品溶液。按“2.3.1”項色譜條件進樣測定，以黃芪甲苷進樣量的對數(shù)為橫坐標（x）、峰面積的對數(shù)為縱坐標（y）繪制標準曲線，計算回歸方程。結(jié)果，黃芪甲苷在進樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，詳見表2。

2.3.5 檢測限與定量限考察 精密吸取“2.3.2”項下對照品溶液適量，加甲醇倍比稀釋后，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限;當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限，結(jié)果見表2。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取“2.3.2”項下對照品溶液適量，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖。結(jié)果，黃芪甲苷峰面積的RSD為0.67%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：190615），分別于室溫條件下放置0、2、5、8、10、12 h時，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果，黃芪甲苷峰面積的RSD為1.15%（n=6），表明供試品溶液在室溫12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復性試驗 取同一批凍干粉樣品（批號：190615）6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜峰，并按外標法計算含量。結(jié)果，黃芪甲苷平均含量為0.398 mg/g，RSD為0.74%（n=6），表明方法重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取凍干粉樣品（批號：190615）6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入黃芪甲苷對照品溶液適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算黃芪甲苷的加樣回收率。結(jié)果，黃芪甲苷平均加樣回收率為101.3%（RSD=0.99%，n=6），詳見表4。

表4 黃芪甲苷回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.4 圣愈湯凍干粉中4個成分的含量測定

2.4.1 阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯的含量測定 取3批凍干粉樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，按外標法計算阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯的含量。每批樣品平行2份測定。結(jié)果，不同批次阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯含量的均一性較好，詳見表5。

2.4.2 黃芪甲苷含量測定 取3批凍干粉，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，每批平行2份，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，測定黃芪甲苷的含量。結(jié)果，不同批次黃芪甲苷含量的均一性較好，詳見表5。

表5 3批圣愈湯凍干粉中阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯和黃芪甲苷的含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯供試品溶液制備方法的選擇

本試驗在建立阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯的含量測定方法時，首先考察了甲醇、70%甲醇和50%甲醇3種提取溶劑的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇對目標成分的提取率更高;另外，考察了超聲時間對目標成分提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲30 min與45、60 min的效果相當。因此，阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯含量測定供試品溶液的制備方法為用70%甲醇超聲處理30 min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本試驗在建立阿魏酸、毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯的含量測定方法時，首先用DAD進行了全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在330 nm波長下基線平穩(wěn)，主峰相對峰面積較大;又對比了流動相甲醇-水和乙腈-水，發(fā)現(xiàn)甲醇-水對毛蕊花糖苷和藁本內(nèi)酯的分離效果更好，但是導致阿魏酸色譜峰有明顯拖尾，故在水相中加入0.1%磷酸，使峰形得以改善;另對不同品牌色譜柱Inertsil ODS-SP C18、Kromasil C18和Cosmosil-5C18-MS-Ⅱ進行了比較，發(fā)現(xiàn)采用Inertsil ODS-SP C18時對上述3個目標峰的分離度和峰形更好，而Kromasil C18更適合用于分析黃芪甲苷。

綜上所述，本試驗建立的同時測定阿魏酸、毛蕊花糖苷、藁本內(nèi)酯和黃芪甲苷4種成分含量的方法具有重復性好、結(jié)果穩(wěn)定可靠、操作簡單等特點，對圣愈湯凍干粉的質(zhì)量進行整體控制有重要意義。

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（收稿日期：2019-08-26 修回日期：2019-09-20）

（編輯：劉 萍）