關(guān)于“煙草花葉病毒的感染和重建實(shí)驗(yàn)”的幾個疑惑點(diǎn)探析

盛國躍

摘要：主要以Fraenkel-Conrat H，Williams R C于1955年發(fā)表的《Reconstitution of active tobacco mo-saic virus from Its inactive protein and nucleic acid components》（《活性煙草花葉病毒活性蛋白及核酸成分的重組》）Fraenkel-Conrat H，Singer B于1957年發(fā)表的《Virus reconstitution：Ⅱ.Combination ofpro-tein and nucleic acidfrom different strains》（《病毒重組：Ⅱ來自不同品系的蛋白質(zhì)與核酸的結(jié)合》）兩篇論文為依據(jù)，對學(xué)生在學(xué)習(xí)煙草花葉病毒的感染和重建實(shí)驗(yàn)過程中經(jīng)常產(chǎn)生的三個疑惑點(diǎn)進(jìn)行探析。

關(guān)鍵詞：煙草花葉病毒 病毒感染 病毒重建

中圖分類號：Q-49 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：E

煙草花葉病毒的感染和重建實(shí)驗(yàn)是證明核酸是遺傳物質(zhì)的證據(jù)鏈中關(guān)鍵的一環(huán)。學(xué)生在學(xué)習(xí)時，經(jīng)常h會對該實(shí)驗(yàn)中的幾個操作產(chǎn)生疑惑。其原因有：①在經(jīng)全國中小學(xué)教材審定委員會2004年及2019年初審?fù)ㄟ^的各個版本高中生物學(xué)教材中對這一實(shí)驗(yàn)的介紹都很少，如人教版只是簡單地說明了實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，蘇教版只以“知識海洋”的方式做了簡介，浙科版對這一實(shí)驗(yàn)的著墨相對較多，但也基本沒有提及具體的操作過程。②與生物學(xué)教學(xué)相關(guān)的雜志中，這方面的相關(guān)論文也極少，在中國知網(wǎng)上以煙草花葉病毒為關(guān)鍵詞，以生物學(xué)通報為文獻(xiàn)來源進(jìn)行檢索，只搜到3篇論文。下面以浙科版教材為例，對學(xué)生經(jīng)常產(chǎn)生的三個疑惑點(diǎn)進(jìn)行探析。

1使煙草花葉病毒感染煙草的操作方法

1.1疑惑：如何進(jìn)行煙草花葉病毒感染煙草的操作

在浙科版高中生物學(xué)教材中多次提及“感染”操作，如“用RNA和蛋白質(zhì)分別去感染煙草”“分別來自不同病毒株系的RNA和蛋白質(zhì)混合后感染煙草”等。但教材中并未提及“感染”的具體操作方法，在其他章節(jié)中也未出現(xiàn)可供參考的內(nèi)容，這讓許多學(xué)生對此中產(chǎn)生疑惑。

1.2解析：感染操作采用常規(guī)的摩擦接種法

煙草花葉病毒有很多類型，不同類型的侵染方式不同。它們都無特殊的吸附結(jié)構(gòu)，故只能以被動方式侵入，如借助于昆蟲的刺吸式口器或植物天然傷口侵入。其中，TMV可通過相鄰葉片摩擦形成的輕微傷口入侵。在自然條件下。被煙草花葉病毒侵染后的種子、葉片等是主要侵染源。煙株發(fā)生感染的主要時期是苗期至現(xiàn)蕾期，此時煙株抵抗煙草花葉病的能力弱，易感病。在本實(shí)驗(yàn)中，使煙草花葉病毒感染煙草的常規(guī)方法是摩擦接種。具體的操作是選取生長期、長勢相同的煙草若干，在葉片表面噴灑金剛砂，用刷子蘸取病毒液輕輕摩擦，重復(fù)幾次。接種后，需用清水輕輕沖洗葉片葉面，以利于植株發(fā)病。由于TMV發(fā)病最適溫度為25～27°C，當(dāng)溫度高于38℃后，病毒會受到高溫的抑制，因此實(shí)驗(yàn)應(yīng)在20～30°溫室內(nèi)進(jìn)行。

2將煙草花葉病毒的RNA與蛋白質(zhì)相互分離的操作方法

2.1疑惑：如何人為地將煙草花葉病毒的RNA與蛋白質(zhì)相互分離

浙科版教材在“煙草花葉病毒（a、b）及其對葉子細(xì)胞的感染和病毒重建（c）”示意圖中標(biāo)出，通過“降解”的方法將TMV的RNA與蛋白質(zhì)相互分離，但沒有寫明其降解的具體方法。受酶解法除去植物細(xì)胞的細(xì)胞壁等知識的影響，多數(shù)學(xué)生錯誤地認(rèn)為在該實(shí)驗(yàn)中也是用酶解法進(jìn)行“降解”的。

2.2解析：用石碳酸處理或堿性洗滌劑處理?？墒篃煵莼ㄈ~病毒的RNA與蛋白質(zhì)相互分離

格勒（Gierer）和施拉姆（Schramm）在進(jìn)行煙草花葉病毒的感染實(shí)驗(yàn)時，采用了將TMV放入水和苯酚（石碳酸）中震蕩的方法，將蛋白質(zhì)和RNA分離（圖1）。其基本操作是將TMV溶液與苯酚的水溶液混合，配制調(diào)成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的十二烷基硫酸鈉（SDS）和物質(zhì)量濃度為0.3 mol/L NaAc的混合溶液。在4°C下劇烈振蕩溶液，離心后取水相，可得到TMV的RNA。

美國加利福尼亞大學(xué)的弗倫克爾·康拉特（H.F.Conrat）和威廉姆斯（R.C.Williams）在進(jìn)行煙草花葉病毒的重建實(shí)驗(yàn)時，采用先將TMV用弱堿性洗滌劑處理，然后通過分別提純的方法將TMV的RNA和蛋白質(zhì)分離。其基本的操作是在3℃條件下，將TMV溶液置于pH為10～10.5的甘氨酸緩沖液或pH為10.5的碳酸氫鹽中透析48～72 h。用冷超速離心法分離除去未降解的病毒，用硫酸銨將上清液調(diào)至pH為0.4的飽和液，并再次離心。離心后，TMV的蛋白質(zhì)主要存在于沉淀中，而RNA主要存在于上清液中。對蛋白質(zhì)部分進(jìn)行重新溶解，經(jīng)在低硫酸銨濃度下沉淀、透析等操作后，可獲得純度高、重組效果好的TMV的蛋白質(zhì)。

從經(jīng)堿降解的TMV中提取的核酸組分，其重組效果不如用洗滌劑法提取的核酸組分。洗滌劑法提取核酸的基本操作是將含有SDS質(zhì)量濃度為1%的病毒溶液的pH調(diào)整為8.5，并在40℃下保持16～20 h。用硫酸銨使蛋白質(zhì)沉淀后，取上清液。將上清液冷藏、離心，并用冷乙醇和pH為5的乙酸鹽進(jìn)一步純化，可獲得重建效果好的TMV的RNA。

3將提純后的RNA和蛋白質(zhì)體外重建的操作方法

3.1疑惑：如何實(shí)現(xiàn)煙草花葉病毒的體外重建

在浙科版教材中，關(guān)于煙草花葉病毒重建操作的相關(guān)表述只有一句：“來自不同病毒株系的RNA和蛋白質(zhì)混合后感染煙草”。至于RNA和蛋白質(zhì)應(yīng)該在什么樣的環(huán)境進(jìn)行混合，混合后又應(yīng)置于什么樣的環(huán)境下等問題都沒有說明。這就容易導(dǎo)致學(xué)生簡單地認(rèn)為，只要病毒的核酸和蛋白質(zhì)在細(xì)胞外相遇，就可以自發(fā)的重建，不需要特殊處理。

3.2解析：體外重建效果受pH和離子強(qiáng)度等因素的影響

TMV結(jié)構(gòu)簡單，是一種典型的棒狀植物病毒，約由2 130個相同的蛋白亞基沿著單鏈RNA螺旋狀而成，有較強(qiáng)的自組裝特性。體外重建的效果受pH和離子強(qiáng)度等因素的影響。弗倫克爾·康拉特和威廉姆斯在進(jìn)行重建活性病毒時的基本操作是將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白質(zhì)溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的核酸溶液按一定比例混合，并添加適當(dāng)?shù)木彌_液，使樣品呈現(xiàn)乳白色。pH為6的醋酸鹽作為緩沖劑的效果最好，但磷酸鹽（pH為6.3或7.0）和乙酸銨（pH為6）也可使用。將樣品置于3℃環(huán)境下保存24 h后，進(jìn)行超速離心，除去不可溶物質(zhì)，獲得乳白色上清液，即可從乳白色上清液中獲得有活性的重組病毒。用電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在重建過程中最初形成的是圓盤狀、帶有中心孔的蛋白質(zhì)聚集體（圖2），最終形成的重組煙草花葉病毒的形態(tài)與正常TMV相同，但短片段比例較大（圖3）。

由于受到課程的性質(zhì)、文本的篇幅等因素的限制，高中生物學(xué)教材不可能對各種生物學(xué)知識都加以詳盡的介紹。學(xué)生在學(xué)習(xí)的過程中也難免會出現(xiàn)一些困惑。在學(xué)生產(chǎn)生困惑之后，教師應(yīng)積極地引導(dǎo)學(xué)生去解決困惑。解決困惑的有效方法之一是查閱科學(xué)家最初發(fā)表的相關(guān)研究論文。