酶聯(lián)免疫法與全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)乙肝表面抗原的特異度及敏感度比較

林丹麗，陳機(jī)瓊，馮慧艷，趙尊，王毅軒

（廣東省東莞樟木頭醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 東莞 523633）

乙型肝炎（乙肝）的感染是我國(guó)肝硬化、肝癌患者發(fā)病的重要因素，及時(shí)有效的防治對(duì)減少肝臟疾病的發(fā)生具有重要意義。乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）作為乙肝病毒表殼蛋白，具有傳染性，通常與乙肝病毒共存，且存在于人體唾液、血液、汗液及分泌物中，臨床常作為乙肝病毒感染的關(guān)鍵標(biāo)志物。我國(guó)當(dāng)前正常人群中血清HBsAg 含量低于0.5 IU/mL 的感染患者占近3%，此類人群多因試劑、檢測(cè)方法等諸多因素?zé)o法檢出，在此情況下，選擇具有高靈敏度的試劑和檢測(cè)方法對(duì)HBsAg 陽(yáng)性的患者具有重要意義［1-2］。血清HBsAg 的檢測(cè)方法多樣，最為普遍的為酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA），如今隨著檢驗(yàn)技術(shù)的更新，化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay,CLIA）亦被逐步推廣［3-4］。本文參考中和確認(rèn)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)203 例患者HBsAg 的檢測(cè)，比較酶聯(lián)免疫法與化學(xué)發(fā)光法的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院2017 年3 月至2019 年3 月就診的203 例患者，利用真空采集管收集所有患者外周血標(biāo)本，且無(wú)黃疸、無(wú)溶血、無(wú)脂濁，經(jīng)10 min 高速離心后備檢。本次試驗(yàn)開(kāi)展前經(jīng)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 試劑和儀器

ELISA 法：選用北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司提供的試劑以及質(zhì)控物，采用KC100 酶標(biāo)儀；CLIA 法：選用深圳新產(chǎn)業(yè)公司提供的化學(xué)發(fā)光分析儀（MAGLUMI 2000 PLUS）及配套試劑、質(zhì)控品和校準(zhǔn)品等。HBsAg 的校準(zhǔn)品和確認(rèn)試劑盒均由深圳新產(chǎn)業(yè)公司提供，溯源至世界衛(wèi)生組織，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，WHO HBsAg，adw2.00/558 亞型。由深圳新產(chǎn)業(yè)公司提供室內(nèi)質(zhì)控與其他儀器，如：低速離心機(jī)（BY-600A 型）、酶標(biāo)全自動(dòng)洗板機(jī)（PW-812）和酶標(biāo)儀（KC100）。以上所有儀器均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，并在試劑有效期范圍內(nèi)使用。

1.3 方法

在檢測(cè)開(kāi)始前對(duì)所有儀器進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控和保養(yǎng)工作，其中室內(nèi)HBsAg 為1.2 IU/mL 的濃度水平，確認(rèn)室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果滿意且儀器正常運(yùn)行后，對(duì)患者血清進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，記錄、保存好相應(yīng)檢查結(jié)果。

ELISA 法：根據(jù)試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行操作，此法出現(xiàn)帶顏色產(chǎn)物，在波長(zhǎng)為450 nm 下利用酶標(biāo)儀對(duì)反應(yīng)孔光密度（optical density，OD）值進(jìn)行測(cè)定，在cut-off 值（臨界值）0.105 及以上的即為陽(yáng)性，以下則為陰性。

CLIA 法：在廠家保養(yǎng)校準(zhǔn)維護(hù)儀器后進(jìn)行分析，根據(jù)作業(yè)相關(guān)指導(dǎo)書進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定質(zhì)控值結(jié)果，當(dāng)S/O＞1.0 判定陽(yáng)性，S/O＜0.9 判定陰性。

中和確認(rèn)試驗(yàn)：嚴(yán)格根據(jù)試驗(yàn)說(shuō)明進(jìn)行操作，試劑與標(biāo)本反應(yīng)COI 值/對(duì)照試劑與標(biāo)本反應(yīng)COI值低于50% 為陽(yáng)性，而50% 及50% 以上則為陰性(Po-Pe)/(1-Pe)=Kappa 值（Po 為觀測(cè)一致率，Pe為期望一致率）。利用SPSS 21.0 軟件計(jì)算受試者工作特征（receiver operator characteristic curve,ROC）曲線下面積，以特異度（假陽(yáng)性率）為橫坐標(biāo)，靈敏度（真陽(yáng)性率）為縱坐標(biāo)繪制曲線。

對(duì)ELISA 法、CLIA 法的靈敏度、特異度、符合率、Kappa 值及ROC 曲線下面積做好分析比較。

其中Kappa 值可反應(yīng)兩種檢測(cè)方法對(duì)比中和確認(rèn)試驗(yàn)的吻合率，Kappa 值＜0 表明極差；0.00～0.20 為微弱；0.21～0.40 為弱；0.41～0.60 為中度；0.61～0.80 為高度；0.81～1.00 為極強(qiáng)。靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%；符合率＝（真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Excel 錄入試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)全部結(jié)果進(jìn)行分析。應(yīng)用SPSS 19.0 分析，計(jì)量資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較

203 例標(biāo)本CLIA 法檢測(cè)陽(yáng)性48 例，ELISA 法陽(yáng)性46 例，標(biāo)準(zhǔn)參考方法中和確認(rèn)試驗(yàn)陽(yáng)性48 例，與CLIA 法結(jié)果一致，見(jiàn)表1。

表1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較 （例）

2.2 兩種方法檢測(cè)效果比較

針對(duì)同一批樣品，比較中和確認(rèn)試驗(yàn)，ELISA法和CLIA 法均有較高的特異度和符合率，但比較中和確認(rèn)試驗(yàn)靈敏度不同，ELISA 法、CLIA 法的Kappa 值及ROC 曲線下面積，見(jiàn)表2。

表2 兩種方法檢測(cè)效果比較

3 討論

HBsAg 陽(yáng)性為人體感染乙型肝炎病毒的重要指標(biāo)，臨床檢測(cè)過(guò)程中，受檢測(cè)方法、試劑等因素的影響，常存在漏診或誤診的情況，尤其是HBsAg 為弱陽(yáng)性的患者，由于乙型肝炎病毒可經(jīng)多種途徑傳播，一旦出現(xiàn)漏診，可能導(dǎo)致嚴(yán)重后果。因此，選擇具有高靈敏度的HBsAg 檢測(cè)方法具有重要意義［5］。ELISA 法是以放射免疫分析方法為基礎(chǔ)的固相酶聯(lián)免疫法，該法將酶與待測(cè)物經(jīng)化學(xué)反應(yīng)連接，再經(jīng)免疫反應(yīng)將待測(cè)物和固體載體對(duì)應(yīng)抗原、抗體結(jié)合，然后加入底物，使底物與酶產(chǎn)生顏色變化，最后依據(jù)顏色的深淺度對(duì)待測(cè)抗原、抗體的水平進(jìn)行判斷，該法常作為半定量或定性檢測(cè)，對(duì)HBsAg 的檢測(cè)有著高靈敏度、高特異度的優(yōu)勢(shì)，且操作簡(jiǎn)便，具有良好的可重復(fù)性，加之成本較低，臨床使用廣泛。但由于其操作程序繁瑣，在加樣以及洗板等環(huán)節(jié)中很有可能造成誤差，加上外源性、內(nèi)源性等物質(zhì)的干擾，其檢測(cè)結(jié)果精確度常受影響，如果為手工操作，人為誤差不可避免［6-7］。結(jié)合臨床報(bào)道數(shù)據(jù)，當(dāng)HBsAg 基因變異或濃度較低時(shí)，檢驗(yàn)灰區(qū)可能出現(xiàn)，王慶敏等［8］通過(guò)對(duì)7 家不同的HBsAg 篩查試劑進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明“灰區(qū)”的設(shè)置十分必要。因此，為確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性，對(duì)于臨界值周圍的標(biāo)本常須采用中和確認(rèn)試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)檢。

CLIA 法又稱化學(xué)發(fā)光免疫法，是經(jīng)單克隆與多克?。ㄊ?羊）HBs 抗體對(duì)HBsAg 進(jìn)行測(cè)定。待測(cè)的抗原與HBsAg（生物素化/釕復(fù)合物標(biāo)記）單克隆與多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)并形成相應(yīng)抗原-抗體的復(fù)合物，經(jīng)與鏈霉親和素微粒相結(jié)合，在電磁吸附作用下，微粒被吸附于電極板上，經(jīng)電壓作用后復(fù)合物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，其發(fā)光值經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)后，強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度為正比。此法優(yōu)越性明顯，尤其是對(duì)于突變株檢出率更高［9-10］。陳少彬等［11］通過(guò)對(duì)448 例患者血清篩查發(fā)現(xiàn)，CLIA法可降低ELISA 法漏檢HBsAg 的風(fēng)險(xiǎn)。

特異度和靈敏度是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)真實(shí)性的指標(biāo)，特異度是對(duì)實(shí)驗(yàn)明確非病人能力的反映，而靈敏度則是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相應(yīng)患者能力的反映。Kappa 值和符合率是評(píng)價(jià)試驗(yàn)可靠性的指標(biāo)，也是對(duì)診斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)判定結(jié)果一致性的反映［12-13］。本研究采用ELISA 法以及CLIA 法對(duì)203 例患者血清中HBsAg 進(jìn)行檢測(cè)，比較標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，ELISA 法靈敏度低于CLIA 法，CLIA 法有較強(qiáng)的HBsAg 檢出能力最強(qiáng)。部分研究顯示在HBsAg 低于1 IU/mL濃度時(shí)ELISA 法可檢出，最低可達(dá)0.317 IU/mL，而CLIA 法則可低至0.01～0.04 IU/mL（即5×10-6～2×10-5），與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法更加符合。CLIA 法特異度比ELISA 法略高，但CLIA 法靈敏度更高，檢測(cè)結(jié)果更具有可靠性與真實(shí)性。ELISA 法以及CLIA 法Kappa 值分別為0.97 和1，兩法符合率均很高，但CLIA 法符合率更高［14］。ROC 曲線屬于一種準(zhǔn)確、全面且有效的檢驗(yàn)試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法，曲線下面積是對(duì)實(shí)驗(yàn)價(jià)值高低的反映，通常面積越大（接近1.0），表明該診斷越具有更高的真實(shí)性［15］。本次研究的結(jié)果表明ELISA 法與CLIA 法ROC 曲線下面積依次為0.88、0.97，CLIA 法診斷價(jià)值更好。盡管ELISA 法常用于大批量的標(biāo)本檢測(cè)且漏檢率極低，但易受洗滌、加樣、儀器、溫度等因素干擾，與此同時(shí)，由于鉤狀效應(yīng)（HOOK效應(yīng)）、周邊效應(yīng)、干擾物質(zhì)（如類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、自身抗體、脂血、溶血、甲胎蛋白等）因素對(duì)靈敏度亦有一定影響，雙孔檢測(cè)同一樣品時(shí)可出現(xiàn)較大差異A 值，假陰性、假陽(yáng)性常易出現(xiàn)。故ELISA 法需嚴(yán)格把控檢驗(yàn)過(guò)程中所有環(huán)節(jié)。部分研究表明ELISA 法較CLIA 法低3～4 級(jí)的靈敏度，CLIA 法采用全自動(dòng)儀器分析，可達(dá)到0.01～0.04 IU/mL 的靈敏度，且無(wú)需稀釋高濃度的樣品，可達(dá)到1 000 IU/mL 的線性高峰，CLIA 法有極強(qiáng)的抗干擾能力，現(xiàn)已逐漸成為應(yīng)用廣泛的主流方法［16-18］。安靜娜等［19］通過(guò)回顧性分析ELISA 法檢測(cè)及CLIA 法檢測(cè)的HBsAg 結(jié)果，表明CLIA 法和ELISA 法均有較好的符合率，而CLIA 法通過(guò)半定量檢測(cè)，有更高的敏感度，適用于在臨床手術(shù)、血站篩查等對(duì)結(jié)果要求敏感的條件下應(yīng)用。

綜上所述，HBsAg 的中和確認(rèn)試驗(yàn)是有較高靈敏度和特異度的HBsAg 確定檢測(cè)方法，比較中和確認(rèn)試驗(yàn)及ELISA 法、CLIA 法兩種方法可得出以下結(jié)論：ELISA 法作為常規(guī)檢測(cè)方法，有低成本、高靈敏度和特異度等優(yōu)勢(shì)，尤其適用于篩選大批量的體檢標(biāo)本；CLIA 法則有著較寬的線性范圍和高特異度、靈敏度，適用于HBsAg 的定量檢查，亦可檢測(cè)ELISA 法的灰區(qū)結(jié)果，避免HBsAg低濃度或變異時(shí)的漏檢。CLIA 法有著可靠、準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)方法有著很高的符合率，診斷價(jià)值極高，但常受儀器設(shè)備以及高昂的試劑價(jià)格等因素限制。因此，針對(duì)HBsAg 檢測(cè)方法可根據(jù)需求進(jìn)行選擇，條件允許范圍內(nèi)可直接采用CLIA 法。