探討樣本吸附反應(yīng)杯對臨床檢驗結(jié)果的影響及解決辦法

逯陣毫，王玉堂，李林，付光宇，吳學(xué)煒

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）是一類嚴重危害人類健康、引起皮膚病和性病的常見病原體，HSV 共有兩種亞型：HSV-1、HSV-2，HSV-2 主要是通過性傳播，對孕婦孕前篩查有重要的臨床意義［1］。臨床檢測HSV-2IgG 多采用的間接法反應(yīng)模式［2］，其特點是所用酶標抗體為特異性動物抗人IgG 抗體［3］。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光平臺的反應(yīng)杯材質(zhì)多為聚丙烯，此材料表面疏水性較強［4］，容易與蛋白通過疏水作用力結(jié)合，導(dǎo)致蛋白吸附到反應(yīng)杯表面［5］，包括血漿中的免疫球蛋白［6］，最終導(dǎo)致酶標記的二抗特異性結(jié)合反應(yīng)杯內(nèi)壁的抗體球蛋白，此時，反應(yīng)杯充當(dāng)了固相載體，導(dǎo)致最終檢測信號值異常偏高，出現(xiàn)假陽性。有文獻報道，表面活性劑可起到抑制蛋白對界面的吸附作用［7］，本文利用非離子表面活性劑Triton X-100 可有效抑制吸附樣本的假陽性。

1 材料與方法

1.1 標本

標本來源于婦幼保健院2017 年8～10 月優(yōu)生優(yōu)育篩查血漿樣本，于-20℃冷凍保存，共15 份，復(fù)溶后狀態(tài)為黃色澄清液體。

1.2 試劑與儀器

某廠家單純皰疹病毒Ⅱ檢測試劑盒（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）及其配套檢測儀器；Trinity 單純皰疹病毒Ⅱ檢測試劑盒［酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）］；Triton X-100 （分 子生物 學(xué)），Sigma-Aldrich；NaH2PO42H2O，分 析 純，國 藥 化 學(xué) 試 劑；Na2HPO412H2O，分析純，國藥化學(xué)試劑。

1.3 方法

1.3.1 平臺對比 ELISA 法按產(chǎn)品說明書進行主要步驟有：加樣、孵育、洗板、加酶、底物、顯色、比色。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法為全自動系統(tǒng)，設(shè)計好標本位置、檢測項目，按開始鍵即可。15 份標本分別在兩平臺進行測試，測試前標本均用生理鹽水（0.9%NaCl 溶液）稀釋30 倍。將平臺間測試結(jié)果進行比對，確認平臺間存在差異的樣本。

1.3.2 拆分實驗 配置0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），用來替換試劑盒中磁微粒組分，試劑盒中其他組分不變，此組合標記為實驗組，正常未替換的試劑盒標記為對照組，然后分別利用對照組和實驗組試劑盒對15 份樣本進行測試，將兩組實驗結(jié)果進行比對，重點關(guān)注平臺差異性標本的檢測結(jié)果。見表1。

表1 拆分實驗方案

1.3.3 添加Triton X-100 驗證 配置0.5%Triton X-100 生理鹽水溶液，標本按照1∶29 稀釋后，重復(fù)拆分實驗的方法，比較兩組檢測結(jié)果。

1.3.4 結(jié)果判定 ELISA 平臺＞0.15 AU/mL 為陽性，磁微?；瘜W(xué)發(fā)光平臺＞12 AU/mL 為陽性。

2 結(jié)果

2.1 平臺比對

15 例標本分別在磁微粒和ELISA 平臺檢測，見表2。

表2 平臺比對結(jié)果 (AU/mL)

2.2 拆分實驗

試劑盒中磁微粒組分替換為磷酸鹽緩沖液后，15 例標本在磁微?；瘜W(xué)發(fā)光平臺檢測，拆分實驗結(jié)果見表3。

表3 拆分實驗結(jié)果 (AU/mL)

2.3 生理鹽水添加Triton X-100

生理鹽水中添加0.5% Triton X-100 后，按照1∶29 稀釋15 例標本，重復(fù)拆分實驗步驟，添加Triton X-100 結(jié)果見表4。

表4 生理鹽水添加Triton X-100 結(jié)果 （AU/mL）

3 討論

蛋白吸附現(xiàn)象普遍存在于自然界中，已有文獻專門報道蛋白吸附動力學(xué)［7］，抑制蛋白在表面的吸附已成為熱門研究方向。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光在應(yīng)用過程中存在多種干擾因素，免疫球蛋白吸附［8］已成為干擾測試結(jié)果的重要原因。磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法和ELISA 法都為間接免疫分析法，但由于ELISA 法板孔內(nèi)預(yù)包被了抗原，起到了封閉作用，所以標本中的免疫球蛋白無法吸附到ELISA板上；而磁微粒化學(xué)發(fā)光法中的反應(yīng)杯沒有經(jīng)過封閉劑封閉，所以很容易與免疫球蛋白非特異性結(jié)合，同時本文提到的拆分實驗也排除了酶標抗體直接吸附反應(yīng)杯表面的可能，最終與酶標記的抗人免疫球蛋白抗體特異性結(jié)合，可以簡單地認為是酶標記的抗體通過免疫球蛋白間接固定在反應(yīng)杯表面上，導(dǎo)致的檢測結(jié)果異常。

標本經(jīng)過含有表面活性劑的生理鹽水稀釋后，原本假陽性的標本結(jié)果變成了陰性，說明加入的表面活性劑抑制了非特異性結(jié)合的數(shù)量，但同時也有文獻報道，并非所有的表面活性劑都可以有效的降低吸附的概率［9］，也并非在任何時間加入表面活性劑都可以抑制非特異性吸附，本文提到的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒酶結(jié)合物中證實含有Triton X-100，但結(jié)果表明非特異性吸附并未得到有效阻止，這或許與蛋白吸附的不可逆性有直接關(guān)系［10］。