miR-223在腎透明細(xì)胞癌患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義

陳明成，賈洪濤

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)湖北醫(yī)藥學(xué)院 研究生培養(yǎng)基地，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院泌尿外科，湖北 十堰 442000）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma,RCC）由于其轉(zhuǎn)移潛力高，是死亡率最高的泌尿?qū)嶓w腫瘤，且大約90% 的腎惡性腫瘤是RCC。約10%～20% 的病例在診斷時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，約20%～30%在術(shù)后隨訪期間發(fā)生轉(zhuǎn)移［1］。而腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是最常見的組織學(xué)亞型，國內(nèi)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)顯示透明細(xì)胞癌約占腎癌的89.6%［2］。轉(zhuǎn)移性ccRCC 的預(yù)后隨著新的靶向療法得到了改善，但由于大多數(shù)患者出現(xiàn)抗藥性［3］，仍然不佳。若能確定用于ccRCC 篩查、診斷和預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的特定生物標(biāo)志物，將顯著改善此病診斷治療和預(yù)后。盡管進(jìn)行了許多研究，但迄今為止還沒有在ccRCC 中發(fā)現(xiàn)可靠的分子預(yù)后標(biāo)記。miRNA 是脊椎動(dòng)物蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)器，是生長、免疫反應(yīng)、組織發(fā)育和組織特定功能維持等基本生物過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器［4］。GANTIER 等［5］實(shí)驗(yàn)得出的平均miRNA 半衰期為119 h（約5 d）。自從發(fā)現(xiàn)miRNA 參與癌癥發(fā)展以來，研究miRNA 在癌癥中的生物學(xué)作用和臨床相關(guān)性方面取得了顯著進(jìn)展［6］。累積的證據(jù)表明，循環(huán)miRNA 可能可用于檢測(cè)各種不同類型的癌癥，并提供治療干預(yù)［7］。然而，識(shí)別具有臨床價(jià)值的循環(huán)miRNA 仍然是一項(xiàng)耗時(shí)且具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。近年來，國內(nèi)外對(duì)miR-223 的研究也較多，牛少曦等［8］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-223與ccRCC 的增殖與遷移可能具有重要關(guān)系。查閱文獻(xiàn)可知miR-223 在急性腦梗死、強(qiáng)直性脊柱炎、胃惡性腫瘤患者外周血中表達(dá)異常［9-11］。但關(guān)于ccRCC 患者外周血中miR-223 的表達(dá)水平還有待進(jìn)一步研究。所以本研究旨在探討血漿miR-223水平診斷ccRCC、判斷其預(yù)后及其與患者病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年8 月至2019 年7 月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院診斷為ccRCC 患者的術(shù)前及術(shù)后7 d（miRNA 半衰期約為119 h）外周血漿標(biāo)本40 例為實(shí)驗(yàn)組，其中男26 例，女14 例；年齡54～76 歲；運(yùn)用TNM 分期分類，Ⅰ期腫瘤6 例，Ⅱ期腫瘤13 例，Ⅲ期腫瘤14 例，Ⅳ期腫瘤7 例。另收集2017 年8 月至2019 年7 月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院門診體檢的健康志愿者外周血液標(biāo)本80 例為對(duì)照組，其中男50 例，女30 例；年齡50～70 歲。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所抽取的靜脈無菌血樣經(jīng)過靜置離心后取上清，保存于-80℃冰箱中冷藏。本研究經(jīng)本院倫理審查委員會(huì)審查通過，標(biāo)本獲取得到實(shí)驗(yàn)對(duì)象本人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 提取血樣總RNA 講行cDNA 逆轉(zhuǎn)錄 首先從-80℃的冰箱中抽取實(shí)驗(yàn)所需的血樣，根據(jù)RNA 提取試劑盒的說明，使用Qiagen RNeasy lipid mini kit 試劑盒提取血液樣品中的總RNA，采用紫外分光光度法測(cè)定提取物的純度和濃度。分別加入M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液、RNA 酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄特異引物，使用Taqman miRNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。逆轉(zhuǎn)錄特異引物序列為：CTCACAGTACGTTGGTATCCTTGTGATGTTTCGAT GCCATATTGTACTGTGAGTGGGGTAT。反應(yīng)條件依次為16℃30 min；40℃30 min；80℃6 min。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)血樣miR-223 表達(dá)量按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說明書，使用ABI 7500 PCR 儀進(jìn)行熒光定量，以u(píng)6 作為對(duì)照，對(duì)樣品中的miR-223 的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。u6 引物序列為：上游引物5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；下游引物5'-AAGGAAGCGCTGGATG-3'。反應(yīng)條件依次為：95℃變性60 s；55℃10 s；55℃10 s。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)所得的CT 值得出腎癌患者術(shù)前血漿、腎癌患者術(shù)后血漿、健康人群外周血漿中miR-223的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。miR-223相對(duì)水平均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，行t檢驗(yàn)；用Spearman 法分析miR-223 在外周血中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系；用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線評(píng)價(jià)外周血中的miR-223 表達(dá)水平在ccRCC 中的診斷價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-223 在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組外周血漿中的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）測(cè)得各組外周血漿中miR-223 的表達(dá)量，如表1 所示，實(shí)驗(yàn)組患者術(shù)前外周血中miR-223 的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.968,P=0.013）；實(shí)驗(yàn)組患者術(shù)后7 d 較術(shù)前外周血中miR-223 的表達(dá)量已明顯減少，但仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.210,P=0.027）。

表1 各組中外周血miR-223 的相對(duì)表達(dá) （）

表1 各組中外周血miR-223 的相對(duì)表達(dá) （）

2.2 ccRCC 患者外周血中miR-223 的表達(dá)與腫瘤病理、患者臨床特征的關(guān)系

如表2 所示，miR-223 在外周血中的表達(dá)與腫瘤TNM 分期、腫瘤大小（腫瘤最大直徑）、腫瘤分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤分期越靠后、體積越大、分化越差，其表達(dá)量則越高；與患者年齡、性別、腫瘤有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 外周血中miR-223 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

表2 外周血中miR-223 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

2.3 外周血中miR-223 的表達(dá)診斷ccRCC 的臨床價(jià)值

如圖1 所示，ROC miR-223 曲線下面積為0.893?？芍庵苎衜iR-223 的表達(dá)在區(qū)分ccRCC 患者和健康人群中具有較高診斷價(jià)值，對(duì)ccRCC 的診斷具有較高的敏感性和特異性。

圖1 miR-223 診斷ccRCC ROC 曲線分析

3 討論

ccRCC 在腎臟近端小管中發(fā)展，與希佩爾·林道綜合征（von Hippel-Lindau disease，VHL 綜合征）腫瘤抑制基因的雙發(fā)失活有關(guān)。VHL 綜合征是由VHL 基因的生殖系點(diǎn)突變引起的遺傳性疾病，其特征是各種良性和惡性腫瘤的易感性。根據(jù)患者的基因型，VHL 綜合征可分為四個(gè)亞型（1、2A、2B 和2C），它們與不同的表型相關(guān)，只有1 和2B 亞型使患者易患ccRCC［12］。

miRNA 被公認(rèn)為與癌癥形成和進(jìn)展高度相關(guān)。累積的研究數(shù)據(jù)揭示了miRNA 的致癌性和腫瘤抑制性，它可以調(diào)節(jié)各種人類癌癥的靶基因。miRNA 通過在特異性mRNA 的3+未翻譯區(qū)域（3+-UTR）內(nèi)進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)來發(fā)揮生物功能，這通常通過mRNA 降解或轉(zhuǎn)化抑制的方式導(dǎo)致靶基因表達(dá)的降低。自從發(fā)現(xiàn)miRNA 參與癌癥發(fā)展以來，研究miRNA 在癌癥中的生物學(xué)作用和臨床相關(guān)性方面取得了顯著進(jìn)展。證據(jù)表明，miRNA 在正常組織和癌癥組織之間表達(dá)不同，并且這種表達(dá)在不同的癌癥類型之間也不同，這為癌癥研究開辟了新的途徑［13］。特別是一些細(xì)胞外miRNA 在血液中以相當(dāng)穩(wěn)定的形式循環(huán)，其循環(huán)特征被發(fā)現(xiàn)與幾種癌癥的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。以往的研究也證實(shí)循環(huán)miRNA 可能可用于檢測(cè)各種不同類型的癌癥，并提供治療干預(yù)［14］。此后，miRNA 一直被用來作為研究各種類型癌癥等疾病的生物學(xué)標(biāo)志物。早在2009 年，VASILESCU 等［15］首次報(bào)道血漿中的miR-150 可用作血清生物標(biāo)志物，用于診斷敗血癥患者。

已有研究表明miR-223 在許多人類癌癥中具有上調(diào)作用，包括結(jié)腸直腸癌［16］、肺癌［17］和胃癌［18］。查閱文獻(xiàn)可知miR-223 在急性腦梗死、強(qiáng)直性脊柱炎、胃惡性腫瘤患者外周血中表達(dá)異常［9-11］。但關(guān)于ccRCC 患者外周血中miR-223 的表達(dá)水平還有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，ccRCC患者術(shù)前外周血中miR-223 的表達(dá)量顯著高于健康人群；ccRCC 患者術(shù)后7 d 外周血中miR-223 的表達(dá)量較術(shù)前已明顯減少，但仍高于健康人群。并且ccRCC 患者TNM 分期越靠后、腫瘤大小越大、腫瘤分化程度越低，miR-223 循環(huán)表達(dá)量越高，其表達(dá)量與患者的年齡、性別、腫瘤有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系。miR-223 ROC 曲線下面積為0.893，可知外周血中miR-223 的表達(dá)在區(qū)分ccRCC 和健康人群中具有較高診斷價(jià)值，對(duì)ccRCC 的診斷具有較高的敏感性和特異性。

綜上所述，miR-223 可能成為診斷ccRCC 的血清生物學(xué)標(biāo)志之一，且與腫瘤的臨床病理特征有一定關(guān)系，對(duì)患者術(shù)后的復(fù)查及預(yù)后亦有一定幫助。但本研具有局限性，在實(shí)際中的應(yīng)用仍需擴(kuò)大樣本量，行進(jìn)一步的研究。