氯霉素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

郭秀麗,趙麗花,龐永宏,梁建飛,牛斌,魏東

（1.張家口市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心,河北張家口075000；2.康保縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,河北康保076650；3.張家口市食品藥品檢驗(yàn)中心,河北張家口075000；4.張家口市宣化區(qū)顧家營(yíng)鎮(zhèn)政府,河北張家口075100；5.河北北方學(xué)院河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北張家口075000）

氯霉素（Chloramphenieol,CAP）屬?gòu)V譜抗生素,具有較好的抑菌性,曾被廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)物疾病的治療.但長(zhǎng)期使用易引發(fā)再生障礙性貧血、粒細(xì)胞缺乏癥、灰嬰綜合征以及消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病,造成嚴(yán)重后果[1].因此,世界上許多國(guó)家在法規(guī)中規(guī)定動(dòng)物性食品中不得檢出氯霉素.我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在1999年發(fā)布了《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》,規(guī)定所有食品動(dòng)物的可食用組織中不得檢出氯霉素[2],并于2002年公布了《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》,規(guī)定氯霉素禁止用于食品動(dòng)物[3].目前,微生物法和色譜法是檢測(cè)氯霉素的主要方法[4-6],但因微生物法測(cè)定需要較長(zhǎng)的時(shí)間,且結(jié)果存在很大的誤差,色譜法則需要價(jià)格昂貴的大型儀器等原因,這2種檢測(cè)方法難以普及.近年來(lái),免疫學(xué)檢測(cè)方法因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高效、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),已成為氯霉素快速檢測(cè)技術(shù)的研究和發(fā)展趨勢(shì).本研究利用課題組自制的CAP單克隆抗體和人工合成的包被抗原（CAP-OVA）,優(yōu)化試驗(yàn)反應(yīng)條件,建立了氯霉素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法,以期為動(dòng)物性食品中藥物殘留的快速檢測(cè)技術(shù)開(kāi)辟新的思路.

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

氯霉素（CAP）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品研究所；牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（簡(jiǎn)稱：酶標(biāo)二抗）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CAP單克隆抗體、包被抗原（CAP-OVA）、羊血清為項(xiàng)目組自制；雙組分TMB顯色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan FC）,美國(guó)Thermo Scientific公司；微孔板恒溫孵育箱（ST70-2）,深圳市優(yōu)米儀器設(shè)備有限公司；電子天平（JJ100）,北京賽多利斯儀器系列有限公司；96孔可拆酶標(biāo)板,丹麥NUNC公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 包被抗原包被質(zhì)量濃度確定和單克隆抗體稀釋倍數(shù)選擇 采用方陣滴定法[7]測(cè)定包被抗原包被質(zhì)量濃度和抗體的最佳稀釋倍數(shù),將包被抗原由2.000 0 ng/mL開(kāi)始按照2倍比稀釋至0.062 5 ng/mL,縱向加入酶標(biāo)板1-6列中,100μL/孔；將抗體先稀釋2 000倍,按照2倍比稀釋至64 000倍,橫向加入酶標(biāo)板A-F列中,100μL/孔,其余步驟同間接ELISA,選取測(cè)定結(jié)果OD值在1.0左右所對(duì)應(yīng)的包被抗原質(zhì)量濃度和抗體稀釋倍數(shù)為試驗(yàn)體系最佳包被抗原包被質(zhì)量濃度和抗體稀釋倍數(shù).

1.2.2 包被抗原包被方式選擇 按照1.2.1結(jié)果,分別選用4℃過(guò)夜,37℃1 h和37℃2 h三種不同的方式包被,進(jìn)行間接ELISA測(cè)定,選擇陽(yáng)性與陰性O(shè)D值比值（P/N）較高的結(jié)果所對(duì)應(yīng)的方式為最佳包被方式.

1.2.3 封閉方式選擇 按照1.2.1和1.2.2結(jié)果,選擇最佳的包被質(zhì)量濃度和包被方式,進(jìn)行封閉液和封閉時(shí)間的選擇,封閉液分別選取1%的明膠、5%的脫脂奶粉、5%的羊血清、10%的羊血清.每孔添加200μL,用間接ELISA法測(cè)定OD值,選取P/N值高的為最適封閉液.封閉液確定后,分別選擇37℃0.5 h、37℃1 h和37℃2 h三種封閉方式,通過(guò)間接ELISA法檢測(cè),選取P/N值高的為最佳封閉方式.

1.2.4 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)溫度和時(shí)間選擇 把6塊酶標(biāo)板平均分成2組,室溫反應(yīng)組和37℃反應(yīng)組,每組3塊酶標(biāo)板反應(yīng)時(shí)間分別為0.5、1.0和2.0 h,進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定其OD值[8],選取在OD值在1.0左右為最適溫度和反應(yīng)時(shí)間.

1.2.5 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間選擇 按照說(shuō)明書(shū),將酶標(biāo)二抗加入酶標(biāo)板中,分別在37℃下孵育0.5、1.0、2.0 h.進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定,選取P/N值高的為酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間.

1.2.6 顯色時(shí)間選擇 按照前面所選擇的條件進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定,分別在室溫下避光顯色5、10、15和20 min.用1 mol/L H2SO4終止反應(yīng),測(cè)定OD值,選取P/N值高的為顯色時(shí)間.

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將 CAP 稀釋成 7 個(gè)質(zhì)量濃度,分別為 1 000.00、100.00、10.00、1.00、0.10、0.01、0 ng/mL.按照所測(cè)定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定.以CAP各個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以各個(gè)質(zhì)量濃度下所測(cè)的OD轉(zhuǎn)化成的結(jié)合律B/B0（抑制率的倒數(shù)）作為縱坐標(biāo),制得CAP測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算曲線回歸方程與相關(guān)系數(shù).

1.2.8 靈敏度確定 隨機(jī)選擇10個(gè)孔做零標(biāo)準(zhǔn)品間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,求10個(gè)孔OD值的標(biāo)準(zhǔn)差SD值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)（B0-2SD）的質(zhì)量濃度即為此方法的最低檢測(cè)限（靈敏度）.

2 結(jié)果與分析

2.1 包被抗原包被質(zhì)量濃度和單克隆抗體稀釋倍數(shù)

OD值在1.0左右時(shí)的包被抗原質(zhì)量濃度為0.250 0 ng/mL,單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1∶32 000,為包被抗原最佳質(zhì)量濃度和單克隆抗體最佳稀釋倍數(shù).

2.2 包被抗原包被方式

包被抗原包被方式測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1.

由圖1可知,37℃1 h時(shí)P/N值最高,選擇37℃1 h為最佳包被方式.

2.3 封閉方式

封閉方式測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3.

圖2 封閉液確定Fig.2 Determination of theblockingsolution

圖3 封閉時(shí)間確定Fig.3 Determination of the blocking time

由圖2和圖3可知,25%羊血清封閉時(shí)P/N值最高,封閉時(shí)間為37℃2.0 h時(shí)P/N值最高,因此,5%的羊血清37℃封閉2.0 h為最佳封閉方式.

2.4 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)溫度和時(shí)間

競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)溫度和時(shí)間測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 抗原抗體最佳時(shí)間確定Tab.1 Determination of the optimal timefor antigen and antibody

由表1可知,室溫2 h和37℃1.0 h時(shí),OD值都接近1,為了節(jié)約檢測(cè)時(shí)間,選取37℃1.0 h為最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間.

2.5 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間

酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖4 酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間確定Fig.4 Determination of reaction timeof enzymemarked antibody

由圖4可知,1.0 h時(shí)P/N值最高,因此,選擇1.0 h為酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間.

2.6 顯色時(shí)間

顯色時(shí)間測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5.

圖5 顯色時(shí)間確定Fig.5 Determination of color renderingtime

由圖5可知,當(dāng)顯色時(shí)間為15 min時(shí)P/N值最高,所以,確定顯色時(shí)間為15 min.

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6.用Excel軟件分析數(shù)據(jù),擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-10.7x+66.042,R2=0.996 9.

圖6 Ci-ELISA測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of Ci-ELISA

2.8 靈敏度

靈敏度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 靈敏度確定Tab.2 Determination of sensitivity

由表2可知,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上（B0-2SD）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為1.01 ng/mL.0.1～100.0 ng/mL線性良好,故最佳檢測(cè)范圍為0.1～100.0 ng/mL.

3 結(jié)論與討論

由于氯霉素的副作用對(duì)人體傷害嚴(yán)重,該藥已被較多國(guó)家禁用.我國(guó)也禁止氯霉素用于所有食品動(dòng)物,在動(dòng)物性食品中不得檢出.因此,檢測(cè)方法對(duì)氯霉素的檢測(cè)限越低越好,基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法因其特異性強(qiáng)和檢測(cè)限低的特性,成為我國(guó)禁用藥物檢測(cè)的主要方法.本文所采用的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法是針對(duì)小分子藥物檢測(cè)的常用免疫學(xué)檢測(cè)方法之一.

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法中,操作步驟極其重要,其中任何一個(gè)條件不合適,都會(huì)影響整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果.為了提高檢測(cè)氯霉素殘留的靈敏度和降低最低檢測(cè)限,本試驗(yàn)對(duì)包被方式、抗體稀釋度、封閉方式、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間及顯色時(shí)間等進(jìn)行了選擇,通過(guò)優(yōu)化操作步驟,有助于結(jié)果更加精確.本試驗(yàn)條件下,檢測(cè)方法檢測(cè)限較低,能夠用于動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的檢測(cè).盡管該檢測(cè)方法具有一定的實(shí)用性,但由于在實(shí)際檢測(cè)中還會(huì)遇到許多特殊問(wèn)題,如樣品前處理、環(huán)境、操作人員等因素,可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果,需對(duì)方法進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn),從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性.