長足大竹象成蟲體表揮發(fā)物動態(tài)變化研究

劉麗萍，楊瑤君，龍文聰，廖鴻，付春

樂山師范學院生命科學學院，竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室，樂山 614000

昆蟲體內釋放到體外的信息素在生物個體或群落之間起重要的化學通訊作用，是昆蟲交流的化學分子語言。從生竹的毀滅性害蟲長足大竹象（Cyrtotrachelus buquetiGuer）寡食叢生竹筍，一年發(fā)生一代，每年在地下生活發(fā)育時間長達11 個月，其成蟲單個不同時間在不同地點出土，出土后是如何尋找同伴和配偶的？又是如何聚集到竹筍上取食交配產卵的？同年不同季節(jié)、同天不同時辰的交配、取食、產卵是如何同步的？由此推測成蟲出土后體表揮發(fā)性信號物質及其周期性變化在其取食、交配、產卵過程中起著十分重要的作用。

有關昆蟲體表信息素的報道較多。鞘翅目昆蟲小蠹科(Scolytidae)、天?？?Cerambycidae)及金龜子類等昆蟲體表信息化學物質的分離、鑒定等研究較多[1-7]。目前已鑒定出約20 種金龜子的信息化學物質[8]；天牛雌雄成蟲均可釋放性信息素，如葡萄虎天牛Xylotrechus pyrrhoderu與家天牛Hylotrupes bajulu[9-11]，人工合成的小蠹信息素和寄主信息化學物質已被應用于小蠹類害蟲的防治中，利用寄主植物信息化學物質制備的紅脂大小蠹Dendroctonus valensLeConte引誘劑(RTB lure)已經商品化并得到廣泛應用[12-14]。迄今為止，昆蟲體表信息化學物質已應用于害蟲生物防治中。

目前對長足大竹象生物學特征和化學防治方法兩個方面的研究較多[15-25]。在長足大竹象信息素研究方面，楊樺等（2010）研究了雌雄蟲釋放的性信息素的引誘作用[23]。忙定澤等（2012）驗證了長足大竹象雌蟲存在引誘雄蟲的化學信息素并分析了雌蟲體表提取化合物的成分[26]。關于長足大竹象體表揮發(fā)物質的動態(tài)變化尚未見報道。

本研究采用氣相-質譜聯用分析技術，主要研究以下3 個問題：1）鑒定長足大竹象成蟲體表揮發(fā)物的成分，確定其相對含量；2）分析長足大竹象成蟲體表揮發(fā)物的日變化及旬變化，探討其變化規(guī)律；3)分析長足大竹象雌雄個體信息交流的關鍵揮發(fā)物及其變化特點。以期為利用體表信息物質控制長足大竹象種群數量提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

實驗所用蟲源皆采自樂山市市中區(qū)棉竹鎮(zhèn)，在8月長足大竹象交配高峰期選擇健壯活性強的雌雄成蟲，參照楊瑤君等（2010）[20]在溫度25 ℃、相對濕度75%、光周期12L∶12D 下用新鮮竹筍室內飼養(yǎng)，每2 d 更換1 次竹筍，待實驗檢測分析備用。

1.2 主要儀器

Agilent 7890B-5977A GCMS、HP-5MS 毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、Agilent 7697A 頂空進樣儀（美國安捷倫公司生產）等。

1.3 揮發(fā)物分析

選擇具有品種典型特征的長足大竹象成蟲在氣相色譜-質譜聯用儀上進樣，將饑餓培養(yǎng)12h 后的長足大竹象放置于進樣瓶中靜置2h，采用頂空采樣法對長足大竹象雌雄成蟲體表揮發(fā)物成分進行收集并分析。GC-MS 升溫程序為起始溫度60 ℃，保持1 min，一階以5 ℃/min 升溫至110 ℃，保持10 min；二階以15 ℃/min 升溫至260 ℃，保持2 min。電離方式EI，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍為30～350 amu。參照忙定澤等的方法，活性成分的鑒定根據聯機的Nist14 數據庫檢索并結合質譜圖中分子離子峰和碎片離子峰來定性確定其揮發(fā)物成分，運用峰面積歸一化法，求得各組分相對含量。

1.4 揮發(fā)物的日變化及旬變化測定

8月份是長足大竹象種群密度的高峰期和取食、交配、產卵的主要季節(jié)，因此選定8月測定長足大竹象體表揮發(fā)物的日變化，根據長足大竹象的日活動規(guī)律，每一天測定5 個時間段，分別為9:00-11:00，11:00-13:00，13:00-15:00，15:00-17:00，17:00-19:00，分別統(tǒng)計每個時間段內長足大竹象體表揮發(fā)物的種類及相對含量，重復3 次，以算術平均值進行統(tǒng)分分析，對比分析主要揮發(fā)物的種類及相對含量的日變化規(guī)律。分別統(tǒng)計上、中、下旬長足大竹象體表揮發(fā)物的成分及相對含量，對比分析主要揮發(fā)物的種類及相對含量的旬變化規(guī)律；

2 結果與分析

2.1 體表揮發(fā)物的主要成分及含量

通過GC-MS 分析，獲得了長足大竹象體表揮發(fā)物的總離子流圖（見圖1）。雌、雄蟲揮發(fā)物成分及含量隨時間的變化呈現不同的變化規(guī)律，雌蟲揮發(fā)物峰值在保留時間3.944 min 出現最高峰（見圖1-A）、雄蟲在21.022 min 出現最高峰，次高峰出現于2.515 min（見圖1-B）。

通過譜庫檢索總共鑒定出長足大竹象體表揮發(fā)物28 種（見表1），其中醛類8 種、烴類7 種、胺類4 種、醇類3 種、酸類2 種、酯類1 種。這些物質隨時間的變化規(guī)律各不相同。雌、雄蟲相同的揮發(fā)物共18 種，分別是二甲基硅烷雙醇、已醛、正庚醛、對羥基甲基苯甲醛、苯酚、2-甲基哌嗪，棕櫚酸丁酯、順-9-二十三烯。其中含量最高的為苯酚，在8月上旬雌蟲體表相對含量高達72.62%，其后依次是順-9-二十三烯、已醛、對羥基甲基苯甲醛、壬醛等。此外雌蟲特有的成分相對含量高至低分別為二十一烷、反-2，4-壬二烯醛、2-氨基-5-甲基己烷、乙基己醛、二甲胺5 種物質；雄蟲特有的成分相對含量高至低分別為對羥基苯甲醛、環(huán)丙基甲醇、NEthylcathinone、莨菪堿、N-甲基乙醇胺5 種物質。

2.2 體表揮發(fā)物日、旬變化

2.2.1 雌蟲體表揮發(fā)物成分及其相對含量日變化

雌蟲8月不同時段主要揮發(fā)物種類及數量見表2，由表2 可知，8月上、中、下旬不同時間段成蟲體表揮發(fā)物質種類和數量明顯不同，種類主要有醛、烴、醇、酯、酸及胺等6 大類，其中種類數量最多的是醛類52 種，其次是烴類42 種。醛類物質除8月上旬11—13 時未檢測到外，其余時段均檢測到；烴類物質各檢測時段均出現；酯類從8月中旬開始每個檢測時段均出現；酸類、胺類等均從8月中旬開始出現，8月上旬僅檢測到醛、烴類和1 種醇類。由此推測雌蟲體表信息物質成分應當是醛類、烴類。所檢測到的揮發(fā)物種類：8月上旬15—17時、17—19 時最多，中旬9—11 時最多，下旬各時段均為11～13 種且差異不大。即8月中下旬揮發(fā)物種類逐漸增多，體內分泌物質增多，生命活動也日益增強，此時間段可能是產卵的高峰期。8月中下旬9—11 時是雌蟲體表揮發(fā)物最多、醛類和烴類也最多，意味著9—11 時可能雌蟲一天活動的高峰期。

圖1 長足大竹象雌蟲（A）、雄蟲（B）揮發(fā)成分的總離子流圖Fig.1 Total ion current spectrum of volatile constituents in female (A) and male (B) C. bugueti

醛類物質和酯類物質集中在9—13 時和17—19時出現，其余醇類物質和酸類物質出現的時間較為隨機，其他不同類型的揮發(fā)物也都集中在9—11 時之間出現；8月下旬，雌蟲主要揮發(fā)物種類主要有醛、烴、醇以及胺四類揮發(fā)物，醛類物質最多，胺類物質最少，其中在整個檢測階段都有出現的物質為醛類和烴類，醛類在9—13 時出現的種類最多，其次胺類物質主要集中在13—15 時出現，醇類物質集中出現在13—15 時。綜合上述分析，揮發(fā)物質持續(xù)時間最長、種類最多的是醛類與烴類物質，在每個時間段且每天都有出現。雖然烷類、酚類以及烯類型物質分泌的種類并不多，但是在長足大竹象的揮發(fā)物中，苯酚、二十一烷以及順-9-二十三烯的含量相當高。

8月上旬揮發(fā)物中相對含量隨時間變化明顯的是順-9-二十三烯、二十烷和二十一烷三種物質，如圖3所示，二十一烷在體表揮發(fā)物中的總含量逐漸下降；順-9-二十三烯在11—13 時出現了最高峰之后，相對含量隨著時間推移也在逐漸降低；而二十一烷的相對含量是隨著時間的推移先下降再上升，最低峰和最高峰分別出經GC-MS 分析，雌蟲體表揮發(fā)物總離子流圖中的最高峰基本都出現在19.83 min，對應物質為二十一烷；其后依次為對應的順-9-二十三烯（保留時間20.88 min）、苯酚（保留時間5.42 min）、苯乙醛（保留時間6.82 min）(見圖2）。

總體看來，在11—13 時，15—17 時的三種物質當中二十一烷的相對含量在總揮發(fā)物中最高，達到53.2%（見圖3-A）；8月中旬主要揮發(fā)物變化趨勢較為明顯的是順-9-二十三烯、二十烷、二十一烷、棕櫚酸丁酯以及壬醛五種物質，揮發(fā)物的相對含量隨時間的變化見圖3-B 所示，其中相對含量一直保持在較高水平的是順-9-二十三烯和二十一烷兩種物

質；其他3 種物質的相對含量較低變化幅度較??；8月下旬變化趨勢較為明顯的是順-9-二十三烯、二十一烷、苯乙醛和壬醛四種物質，揮發(fā)物的相對含量隨時間的變化較大的物質見圖7，由圖3 可以看出二十一烷的相對含量一直保持在較高水平，在整個檢測過程中相對含量最高的時候集中于11—13 時，相對含量高達46%；變化趨勢與之相似的還有壬醛，該物質在整個檢測過程中也出現了兩個峰，最高峰同樣位于11—13 時，相對含量為18.0%；苯乙醛變化較平緩，相對含量在15%上下，僅僅在17—19 時出現最低值5.9%；順-9-二十三烯相對含量變化趨勢也較平緩（見圖3-C）。順-9-二十三烯常被用于制作

昆蟲性引誘劑，而八月上中旬正是長足大竹象蟲交配的旺季，雌蟲通過大量分泌順-9-二十三烯吸引雄蟲找到雌蟲交配，直至八月下旬，產卵后的雌蟲壽命將至，各項功能衰退，使得體內順-9-二十三烯、苯酚、二十一烷等物質分泌減少。

表1 長足大竹象雌雄成蟲體表揮發(fā)物相對含量Tab.1 Relative content of volatiles on body surface of male and female C. buqueti

表2 8月雌蟲揮發(fā)物種類變化Tab.2 Variation of body surface volatiles in female C. buqueti in August

圖2 雌蟲揮發(fā)物總離子流圖Fig.2 Total ion current spectrum of surface volatiles in female C. bugueti

圖3 長足大竹象雌蟲主要揮發(fā)物質相對含量的日動態(tài)變化Fig.3 Daily dynamic change of the relative content of main surface volatile substances in female C.buqueti

2.2.2 雄蟲揮發(fā)物成分及相對含量8月日變化規(guī)律

同上8月上旬處于交配前期，雄蟲較中下旬更為活躍，此階段采用上午9 時到晚上20 時每隔兩小時對雄蟲體表揮發(fā)物進行檢測。結果表明，雄蟲最高峰隨時間的變化存在一定差異，但大都出現在保留時間為19.83 min 的物質，對應物質為二十一烷；其次為保留時間12.76 min 所對應的4-羥基-苯甲醛，5.42 min 所對應的苯酚。8月上旬醛類、烴類、醇類、酯類以及酸類物質在檢測的9:00—21:00 都一直存在；其他類型如胺類、物質集中在上午9—13 時和下午15—19 時出現，不同類型的化合物，共同點是13—15 時以及17—19時出現種類最多，頻率最高；8月中旬揮發(fā)物種類變化規(guī)律為烴類、醛類以及酯類物質在檢測的9 時到19 時都一直存在；酸類物質在15—17 時未出現，除此之外胺類物質僅僅在17 時出現了1 次，遠低于上旬胺類物質出現的頻率；其他不同類型的揮發(fā)物在相同時間段內的出現頻率略高于上旬；8月下旬揮發(fā)物種類變化規(guī)律為在檢測的5 個時間段都出現的有醛類、烴類、醇類和酸類物質；除此之外胺類物質僅在13—15 時出現；酯類物質在9—11 時和13—15 時有出現；其他不同類型的物質在11—13 時出現的頻率最高。綜合上中下旬的變化得出，醛類、烴類及醇類物質在每個時間段且每天都有出現（見表3）。

表3 8月雄蟲揮發(fā)物種類變化Tab.3 Variation of surface volatiles of male C. buqueti in August

雄蟲在8月上旬相對含量隨時間變化明顯的主要有醛，醇以及烴類物質，分別是二甲基硅烷雙醇、苯乙醛、壬醛、十九烷、順-9-二十三烯以及二十烷共6 種物質，具體隨時間的變化趨勢如圖2-9所示，其中壬醛、順-9-二十三烯和二十烷三種物質具有相同的變化趨勢，在檢測過程中相對含量的變化呈現雙峰模式，其中最高峰均出現正在下午15—17 時；而二甲基硅烷雙醇和苯乙醛的變化相對平緩無太大起伏，且相對含量也較低；十九烷的變化情況不同于其他幾種物質，該物質在17—19 時相對含量突然降低出現了最低峰（見圖4-A）；8月中旬雄蟲體表揮發(fā)物隨時間變化較大有4 種物質，分別是十九烷、棕櫚酸丁酯、順-9-二十三烯和二十烷四種物質；其中在檢測過程中相對含量一直保持在較高水平的是十九烷和順-9-二十三烯，相對含量最高時分別達到了55%和40%。順-9-二十三烯、二十烷和十九烷三種物質的大致變化趨勢相類似，檢測過程中相對含最低的點都出現在11—13 時，相對含量最高的點出現在15—17時；而棕櫚酸丁酯的變化趨勢剛好與該三種物質相反，相對含量最低時出現在下午15—17 時，相對含量最高值出現在11—13 時（見圖4-B）；8月下旬雄蟲體表揮發(fā)物隨時間變化較大的物質主要有苯乙醛、壬醛和十九烷三種物質，總體來看相對含量較高的為壬醛。其中壬醛和十九烷變化趨勢相同，相對含量隨時間的推移均是先下降后上升，在15—17 時出現相對含量最低的點；苯乙醛的變化趨勢不同于其他兩種物質，在檢測過程中該物質的相對含量隨時間的推移先上升后下降，同樣在15—17 時出現最低值（見圖4-C）。

圖4 雄蟲主要揮發(fā)物質相對含量的日動態(tài)變化Fig.4 Daily dynamic change of the relative content of main surface volatile substances in male C. buqueti

2.3 長足大竹象體表揮發(fā)物成分及相對含量旬變化規(guī)律

2.3.1 體表揮發(fā)物主要成分及相對含量

GC-MS 分析8月上、中、下旬雌雄蟲體表揮發(fā)物成分，得到雌蟲揮發(fā)物共23 種，雄蟲揮發(fā)物共23 種，其中苯乙醛、壬醛、棕櫚酸丁酯、順-9-二十三烯以及二十烷這5 種物質在雌蟲和雄蟲體表揮發(fā)物中均有檢測到。除以上5 種物質之外已醛、正庚醛、二十一烷3 種有機物在雌蟲整個檢測周期當中也很活躍。其相對含量隨時間的變化如圖5-A 所示，由圖可以看出二十一烷在整個8月份相對含量的平均值都保持在較高水平，最高時為8月上旬約43.1%；平均相對含量最低的為棕櫚酸丁酯（僅在8月中旬和下旬檢測到少量；其他幾種物質的變化情況各不相同。而雄蟲體表揮發(fā)物測得的成分當中出現頻率較高的還包括二甲基硅烷雙醇和十九烷這兩種物質。雌蟲主要揮發(fā)物相對含量隨時間的變化如圖5-B 所示，其中順-9-二十三烯的相對含量在8月中上旬均保持較高水平，8月下旬突然驟降；除此之外二甲基硅烷雙醇的平均相對含量一直較其他物質低許多，而十九烷在8月上旬和8月下旬的相對含量都較高，8月中旬卻未能檢測到該物質。

圖5 雌蟲（A）、雄蟲（B）體表揮發(fā)物主要成分相對含量的旬變化動態(tài)Fig.5 Ten-day changes of the relative content of the main content of surface volatiles in female (A) and male (B) C. buqueti

2.3.2 體表揮發(fā)物種類旬變化規(guī)律

長足大竹象體表揮發(fā)物共有28 種，其中醛類物質8 種，烴類物質7 種胺類物質4 種，醇類物質3 種，酸類和酯類物質分別為2 種和1 種，除此之外還有4 種其他不同類型物質。這些物質隨時間的變化規(guī)律各不相同，具體變化情況見圖6。整個檢測過程中醛類物質種類較多，雌蟲8月中旬醛類物質最多，雄蟲體表揮發(fā)物中的醛類則在8月上旬最為豐富；烴類物質也比較豐富，隨著時間的推移烴類物質在8月下旬逐漸減少；除此之外還有胺、醇、酯和酸類物質的變化，其中酯類物質僅棕櫚酸丁酯一種（見表1）；其他不同種類的物質在雄蟲的體表揮發(fā)物中的種類在整個8月都要多于雌蟲。

圖6 長足大竹象體表揮發(fā)物種類隨時間變化情況Fig.6 Variation of body surface volatiles of C.buqueti with time in August

3 討論

本實驗采用頂空采樣法對長足大竹象體表揮發(fā)物成分進行檢測分析，共測得28 種化合物，其中雄蟲23 種，雌蟲23 種，共同揮發(fā)物18 種，其中苯酚含量最高，其后依次是順-9-二十三烯、已醛、對羥基甲基苯甲醛、壬醛等。雌蟲特有的成分相對含量高至低分別為二十一烷、反-2，4-壬二烯醛、2-氨基-5-甲基己烷、乙基己醛、二甲胺5 種物質。雄蟲特有的成分相對含量高至低分別為對羥基苯甲醛、環(huán)丙基甲醇、N-Ethylcathinone、莨菪堿、N-甲基乙醇胺5 種物質。在整個八月，主要揮發(fā)物質有烴、醛、醇、酯、酸及胺類等，其中，種類最多的是醛類，酚類物質最少。醛類與烴類物質在每個時間段且每天都有出現，持續(xù)時間最長、種類最多。

本文研究結果與忙定澤等[26]通過長足大竹象體表粗提液測得的84 種化合物異同。相同點是，雌雄個體體表揮發(fā)物成分具有較大相似性，相同的化合物成分多達19 種。雌蟲主要揮發(fā)物中順-9-二十三烯、二十一烷這兩種物質在整個8月都存在，其中二十一烷的相對含量從上旬到下旬都呈現下降趨勢，且日變化基本一致，表現為先升高后降低。與生活習性聯系。相關研究表明雄性成蟲完成交配后大都會死亡[24]，所以該物質可能是雌蟲揮發(fā)的引誘物質的組成成分，隨著大部分個體都完成交配，雄蟲死亡，雌雄個體之間的引誘物質也逐漸減少。順-9-二十三烯的相對含量在一天中最高峰分別位于9—11 時和15—17 時。雄蟲體表揮發(fā)物十九烷在整個8月都存在，從上旬到中旬相對含量增加，下旬相對含量減少。楊瑤君等[17]在對長足大竹象生活習性的研究中表明，成蟲一天中的出土時間為早晨6—10 時，下午16—19 時，主要活動時間9—19時，由此可以推測該物質可能為起到個體間信息交流的作用，在主要活動時間內該物質的相對含量一直保持較高水平。研究表明長足大竹象成蟲對雌、雄成蟲體表揮發(fā)物質的行為反應的實驗中，雌蟲體表揮發(fā)物對雄蟲有較強引誘作用，但具體的化學成分沒有確定[23]；忙定澤等[26]在長足大竹象雌雄成蟲風洞行為反應的測試中，以雌成蟲作為誘引源時，顯示了較強的引誘活性，進一步證明長足大竹象體揮發(fā)物中的某些成分在個體之間的信息交流之間發(fā)揮著重要作用。但在忙定澤等的實驗中并沒有對體表揮發(fā)物成分進行分析鑒定，而是采用溶劑浸提法對體表信息化學物質進行采集分析，未能明確長足大竹象成蟲體表揮發(fā)物的成分，及其相對含量及物質種類隨時間變化的規(guī)律。本實驗在長足大竹象危害竹林的高峰期8月對其進行采集，利用頂空采樣法檢測竹象蟲體表揮發(fā)物的動態(tài)變化規(guī)律，結果表明雌雄體表體表揮發(fā)物成分大致相同，主要為醛類和烴類物質。楊瑤君等[20]通過GC-MS 對竹筍揮發(fā)物進行分析后發(fā)現其中含有苯酚，說明苯酚在對雄蟲的引誘中所起的重要作用。本實驗在長足大竹象雄性成蟲中檢測到苯酚的存在，該結果進一步證明雌雄個體之間存在相互引誘的信息。

信息素是昆蟲與昆蟲之間相互交流的主要物質，通過昆蟲信息素誘捕昆蟲從而達到昆蟲防控的目的不僅對環(huán)境無污染且人工成本低、誘捕效果顯著。本文通過對長足大竹象的體表揮發(fā)物的動態(tài)變化的研究，為長足大竹象的化學信息素的開發(fā)利用提供了技術支持以及理論基礎。但有關其信息素的成分、比例、分泌性信息素的腺體及其部位等，還有待進一步研究。