柴胡種間序列差異及其遺傳分化

何婷婷， 柴軍紅， 郝婧瑋， 陳瑜欣

(1.牡丹江師范學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157000； 2.重慶市煙草公司彭水分公司， 重慶 彭水 409600)

柴胡屬(Bupleurum)，隸屬于傘形科(Umbelliferae)，多年生草本，是雙子葉植物中的大屬之一。據(jù)報(bào)道，全世界約有柴胡屬植物200余種，我國(guó)已報(bào)道的有36種、17個(gè)變種以及7個(gè)變型[1]。柴胡主要分布于北半球亞熱帶地區(qū)。在中國(guó)，多產(chǎn)于湖北、四川等地。柴胡又名地熏，茈胡，山菜等。

藥用價(jià)值方面的研究表明，柴胡可抗菌[2]、抗癌[3]、保肝護(hù)肝[4]、利膽[5]等。此外，舒璞等[5]通過(guò)數(shù)量分類學(xué)的方法對(duì)柴胡屬植物進(jìn)行了分類方面的研究，更新了中國(guó)柴胡分類系統(tǒng)，其中大柴胡被單獨(dú)列為一個(gè)亞屬并且命名為大葉柴胡亞屬，而其他柴胡屬植物命名為真柴胡亞屬。Liu等研究了不同的海拔高度對(duì)臺(tái)灣柴胡生長(zhǎng)發(fā)育的影響，結(jié)果表明，高海拔地區(qū)的柴胡葉片和根的長(zhǎng)度較大，低海拔下植株高度、根徑大小、根的重量和皂甙含量均較高[6]。

rDNA 基因中，5.8 S和28 S基因間隔的序列稱為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcript Spacer, ITS)，其長(zhǎng)度和序列變化非常大，該片段是由ITS 1、5.8 S和ITS 2三個(gè)區(qū)域組成，其中ITS 1和ITS 2在不同植株中變化較大，承受較小的選擇壓力；5.8 S區(qū)域在不同植株中的變異較小，較為保守，因此，可利用該區(qū)域鑒別不同植株間的親緣關(guān)系[7]。目前，ITS應(yīng)用在較多的植物物種中，農(nóng)作物[8-12]、果蔬[13-16]、花卉[17-19]中均有涉獵。但在中藥研究中應(yīng)用較少。

之前對(duì)于柴胡的研究主要集中在藥用價(jià)值方面，且柴胡作為常用中藥，需求量隨之增加，導(dǎo)致柴胡供不應(yīng)求，市場(chǎng)混亂，真假難辨。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選用柴胡屬10個(gè)種及1個(gè)外類群鞘山穹，詳細(xì)信息見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本研究所需序列全部來(lái)自于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，將下載序列保存為文本文檔格式，然后利用在線對(duì)比軟件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)進(jìn)行序列比對(duì)，分析序列的差異性，整理差異堿基的變異類型，并作出折線圖。利用clustalX 1.83軟件對(duì)序列進(jìn)行對(duì)比，后轉(zhuǎn)化為meg格式，進(jìn)行遺傳距離的計(jì)算和系統(tǒng)聚類分析。

表2 不同樣本的序列分析

樣品編號(hào) ITS ITS1 5.8S ITS2 長(zhǎng)度/bpGC含量/%長(zhǎng)度/bpGC含量/%長(zhǎng)度/bpGC含量/%長(zhǎng)度/bpGC含量/%160458.9421464.0216353.3722758.15260458.6121463.5516353.3722757.71360658.9121461.6816353.3722960.26460658.5821462.1516353.3722958.95560058.5021460.7516353.3722360.09660556.8621260.3816352.1523056.96760458.2821360.5616353.3722859.65860658.7521462.1516353.3722959.39959957.7620959.8116352.7622759.471060558.1821461.2116353.3722858.77

表3 10個(gè)柴胡屬種的ITS遺傳距離分析

樣品編號(hào)123456789101110.00020.0070.00030.0280.0320.00040.0280.0320.0180.00050.1060.1060.0960.1020.00060.0280.0210.0540.0540.1300.00070.0980.0980.0940.1000.0560.1220.00080.0260.0300.0160.0020.1000.0520.0980.00090.1020.1020.0940.0980.0300.1220.0460.0960.000100.0320.0350.0170.0170.1020.0570.1040.0190.1010.000110.3160.3190.3140.3140.3270.3420.3220.3170.3240.3180.000

注：11為鞘山芎。下同。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴胡樣本間的序列分析

2.1.1樣本間堿基變異性研究

10個(gè)樣品柴胡種間堿基的顛換/轉(zhuǎn)換比值存在較大差異，其中出現(xiàn)兩個(gè)峰值，分別對(duì)應(yīng)的是紫花鴨跖柴胡和黑柴胡，說(shuō)明兩者堿基發(fā)生顛換的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)換(圖1)。

2.1.2樣本間GC含量分析

10個(gè)柴胡樣品的ITS全長(zhǎng)在599～606 bp之間，其中5.8S的區(qū)段長(zhǎng)度一致，個(gè)別樣品的GC含量有輕微減少，其余樣品的GC含量一致，說(shuō)明該區(qū)段較為保守。ITS 1和ITS 2區(qū)段的序列長(zhǎng)度及GC含量均存在一定程度的變異，說(shuō)明這兩個(gè)區(qū)段內(nèi)的核苷酸較為多變，能夠提供較為豐富的變異位點(diǎn)(表2)。

注：1為北柴胡；2為銀州柴胡；3為紅柴胡；4為紫花鴨跖柴胡；5為竹葉柴胡；6為馬爾康柴胡；7為小柴胡；8為黑柴胡；9為有柄柴胡；10為大葉柴胡。下同。

2.2 遺傳距離分析

10個(gè)樣本間的遺傳距離在0～0.130之間(表3)，北柴胡和銀州柴胡；紅柴胡和紫花鴨跖柴胡、黑柴胡、大葉柴胡兩兩間的遺傳距離相對(duì)較小，在0.002～0.019之間，其中紫花鴨跖柴胡與黑柴胡間遺傳距離最小，僅有0.002。

圖2 10個(gè)柴胡種ITS系統(tǒng)發(fā)育分析

北柴胡和竹葉柴胡、小柴胡、有柄柴胡；銀州柴胡和竹葉柴胡、小柴胡、有柄柴胡；紅柴胡和紫花鴨跖柴胡、小柴胡、有柄柴胡；紫花鴨跖柴胡和竹葉柴胡、小柴胡、有柄柴胡；竹葉柴胡和馬爾康柴胡、黑柴胡、大葉柴胡種間的遺傳距離表現(xiàn)得相對(duì)較大，在0.094～0.130之間，其中竹葉柴胡和馬爾康柴胡種間的遺傳距離最大，達(dá)0.13。

以上結(jié)果均表明，本研究所選用的10個(gè)柴胡種間的遺傳距離存在顯著差異，各種間遺傳距離跨度較大，說(shuō)明柴胡種間序列差異較大。

2.3 柴胡種間親緣關(guān)系分析

由圖2可知，本研究中所采用的10個(gè)柴胡種主要分成兩大分支：

第一大分支包含小柴胡、竹葉柴胡與有柄柴胡。其中竹葉柴胡和有柄柴胡在同一個(gè)小分支中，同源性較高，達(dá)到94%，推測(cè)竹葉柴胡和有柄柴胡可能來(lái)自同一個(gè)祖先。

第二大分支又分為2個(gè)小的分支，分支Ⅰ中的柴胡種有北柴胡、銀州柴胡和馬爾康柴胡，而北柴胡和銀州柴胡的親緣關(guān)系又較為親近，同源性達(dá)到97%；而分支Ⅱ中的紅柴胡、大葉柴胡雖然和黑柴胡與紫花鴨跖柴胡(黑柴胡與紫花鴨跖柴胡的同源性高達(dá)99%)在同一個(gè)大分支中，但是又各自單獨(dú)在一個(gè)分支內(nèi)，說(shuō)明紅柴胡、大葉柴胡同黑柴胡與紫花鴨跖柴胡等其他種間仍然存在一定差異。而與10個(gè)柴胡屬同科的植物鞘山芎另成一個(gè)大分支，表明鞘山芎與10個(gè)柴胡屬植物差異很大。

3 討 論

柴胡是常見中藥，目前對(duì)于柴胡的研究多集中在其活性成分及其藥用價(jià)值上，對(duì)不同柴胡種間親緣關(guān)系及在某一基因上的序列差異的相關(guān)研究較少。本研究對(duì)10個(gè)柴胡種在ITS基因位點(diǎn)上的序列進(jìn)行親緣關(guān)系的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)個(gè)別種的歸屬與中國(guó)植物志上的分類存在一定差異。本研究結(jié)果顯示，有柄柴胡與竹葉柴胡的序列差異性較小，同源性高達(dá)94%；而在中國(guó)植物志中，有柄柴胡與紫花鴨跖柴胡由于莖基部非木質(zhì)化，葉非橢圓形而聚為一類，但二者之間也存在形態(tài)上的細(xì)微差異，例如莖生葉是否存在柄，具有幾片總苞片。此外，銀州柴胡的歸屬也存在細(xì)微差異，本研究結(jié)果顯示其與北柴胡的親緣關(guān)系較近，而中國(guó)植物志中銀州柴胡與紅柴胡的親緣關(guān)系較近，葉均為線形，根表面均為淡紅棕色。

柴胡作為常用藥，對(duì)流感、感冒等上呼吸道感染有較好療效。本屬中作為中藥原料的約有20余種，其中北柴胡、銀州柴胡、紅柴胡等具有代表性[1]。杜江對(duì)柴胡的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究，結(jié)果表明，只有59.06%的Unigene獲得了不同數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋，另外沒(méi)有注釋到的基因可能是由于其物種的相關(guān)研究信息較少，可參考的數(shù)據(jù)匱乏所致[20]。這就需要后續(xù)的深入研究，對(duì)未注釋到的基因進(jìn)行深度的生物信息學(xué)分析，以期為柴胡種的分類、功能基因的開發(fā)利用提供前期數(shù)據(jù)支撐[20]。