精索靜脈曲張的不育病人精子線粒體DNA片段缺失的調(diào)查

呼明闖,章宏祥，周發(fā)友，高 攀，唐曉磊

精索靜脈曲張是指精索靜脈叢的靜脈發(fā)生異常曲折和擴(kuò)張，是導(dǎo)致男性不育的因素之一。正常男性人群中精索靜脈曲張的發(fā)生率約15%，其中40%導(dǎo)致不育[1]。精索靜脈曲張可導(dǎo)致精子中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平增加，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激。許多研究[2-3]均表明精索靜脈曲張病人的血清、精液、睪丸組織中的氧化應(yīng)激水平升高。當(dāng)然還有一些其他因素，如微量元素、Y染色體微缺失等[4-7]。

有研究[2,8-11]表明，線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的缺陷與男性不育有關(guān)，某些線粒體基因中單核苷酸多態(tài)性和缺失與精子質(zhì)量低下有關(guān)。mtDNA最常見的病理變化是4 977 bp片段的重排或缺失，其中有研究[12-13]報(bào)道在前列腺癌等疾病中存在4 977 bp片段的缺失，4 977 bp片段缺失還是衰老和線粒體功能障礙的標(biāo)志。隨著機(jī)體老化，4 977 bp片段的缺失也在人類的組織中逐漸累積，并與人類精子的死亡率增加、生育能力下降有關(guān)聯(lián)[14-15]。線粒體DNA中4 977 bp片段基因發(fā)生缺失的位置在8 483～13 459 bp之間，而該片DNA中包涵了ATPase 6/8、COⅢ、ND3、ND4L和ND4等許多結(jié)構(gòu)基因和6個(gè)tRNA基因。這些DNA片段編碼的蛋白是呼吸酶，其DNA缺失會(huì)導(dǎo)致ATP生成缺陷。因此,本研究擬對(duì)精索靜脈曲張?jiān)诓挥∪说木觤tDNA 4 977 bp片段缺失中的分布情況加以研究，以期驗(yàn)證其與不育的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 材料 HAM′S F10液清洗(購(gòu)自Sigma公司)；DNA試劑盒(購(gòu)自Tiangen公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合成、純化；DNA ladder、PCR mix擴(kuò)增試劑(購(gòu)自賽默飛公司)；瓊脂糖和TAE電泳緩沖液均購(gòu)自索萊寶公司。

1.2 研究對(duì)象 選取皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2015年3月至2017年8月泌尿男科門診病人，其中經(jīng)篩選60例患有精索靜脈曲張的不育病人(精索靜脈曲張組)和90名健康人(對(duì)照組)納入研究。2組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)，具有可比性。精索靜脈曲張根據(jù)其彩超特點(diǎn)進(jìn)行分級(jí)：Ⅲ級(jí)(大，從病人陰囊表皮處可觀察到)，Ⅱ級(jí)(中等大小，無(wú)需用瓦爾薩爾試驗(yàn)就可探及)，Ⅰ級(jí)(小，需用瓦爾薩爾試驗(yàn)才可探及)[16]。收集所有病人和對(duì)照組具體的既往史，包括職業(yè)、吸煙酗酒史、腹部手術(shù)史。所有病人和對(duì)照組禁欲5 d后手淫法收集精液樣本。所有納入研究的對(duì)象均書面知情同意。本研究獲得皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院?jiǎn)挝粋惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)。

表1 2組研究對(duì)象的基本資料比較

△示t值

1.3 標(biāo)本收集 精液樣本在37 ℃液化，然后分成體積為一次射精量的等份試樣，根據(jù)WHO 1999年的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)精子的濃度和形態(tài)。等待至少30 min直到精液液化，梯度離心收獲精子。收獲的精子用HAM′S F10液清洗，后再3 000 r/min離心5 min，棄上清液，即得精子。

1.4 精子總DNA抽提 用哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA試劑盒抽提每份精子標(biāo)本的總DNA，所得的DNA須符合最佳光密度比A260/A280=1.8及以上，然后儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR 為檢測(cè)在總DNA中有mtDNA，而且存在4 977 bp片段的mtDNA缺失，設(shè)計(jì)了2對(duì)引物。引物序列為MT1 (1 257～1 279):5′ -TAT ACC GCC ATC TTC AGC AAA C-3′，MT2 (1 433～1 411):5′ -TAC TGC TAA ATC CAC CTT CGA C-3′ 和D1(8 416～8 437):5′-CCT TAC ACT ATT CCT CAT CAC C-3 ′，D2 (13 519～13 498):5′-TGT GGT CTT TGG AGT AGA AAC C-3 ′，分別用于檢測(cè)有無(wú)mtDNA和有無(wú)4 977 bp片段 DNA缺失[17]。通過位于高度保守的12S區(qū)域的一個(gè)177 bp長(zhǎng)的序列的擴(kuò)增可確定總DNA中存在mtDNA，通過缺失區(qū)域側(cè)翼的一個(gè)127 bp長(zhǎng)的產(chǎn)物可確定存在4 977 bp片段 DNA缺失。PCR的反應(yīng)體系為：20 ng的基因組DNA，25 μL 2×PCR mix、10 pmol上下游引物各1 μL,補(bǔ)足水至總反應(yīng)體積50 μL。PCR運(yùn)行體系為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、60.5 ℃退火45 s、72 ℃延伸30 s，此三步30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后，取6 μL PCR產(chǎn)物，加1 μL 6×Loading buffer，在緩沖液為1×TAE、2.5 %瓊脂糖中電泳。然后在紫外燈下顯影。所有存在模糊不清的標(biāo)本均進(jìn)行重復(fù)以保證結(jié)果質(zhì)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，有2條條帶，大小分別為127 bp和177 bp(見圖1)。所有DNA樣本用mtDNA12S區(qū)域引物擴(kuò)增均成功得到產(chǎn)物，大小為177 bp的條帶證實(shí)了在總DNA中有mtDNA的存在，大小為127 bp的條帶擴(kuò)增自mtDNA缺失的4 977 bp片段。電泳結(jié)果顯示，60例精索靜脈曲張組病人中有52例病人的精子mtDNA存在4 977 bp片段的缺失，而90例對(duì)照組中4例存在4 977 bp片段的缺失(χ2=104.03，P<0.01)。在81.66%的患有精索靜脈曲張的不育病人和4.44%的健康人存在DNA 4 977 bp片段的缺失，結(jié)果顯示，mtDNA 4 977 bp片段的缺失與精索靜脈曲張導(dǎo)致的不育有關(guān)聯(lián)(OR=139.80，95%CI=40.08～487.30，P<0.01)。

3 討論

本次研究表明，精索靜脈曲張病人中精子mtDNA 4 977 bp片段缺失的頻率比健康人更高，而且精子中這一DNA片段的缺失可能會(huì)導(dǎo)致病人不育。CHEN等[7]研究表明，患有精索靜脈曲張的不育病人、亞臨床精索靜脈曲張的不育病人和健康年輕男性的精子mtDNA 4 977 bp片段的缺失頻率分別為41.3%、17.7%和1.67%。

精子功能障礙被認(rèn)為是導(dǎo)致男性不育的最主要的原因。mtDNA中ATP生成基因的突變會(huì)影響精子的活動(dòng)能力，而精子的活動(dòng)能力低下是不育的重要影響因素，因此mtDNA的突變可能會(huì)損害精子的活動(dòng)能力[18]。線粒體最早被發(fā)現(xiàn)與男性不育存在關(guān)聯(lián)始于20世紀(jì)90年代早期，當(dāng)時(shí)的研究者報(bào)道在精子活動(dòng)能力降低的男性中存在線粒體結(jié)構(gòu)缺陷[18]。mtDNA突變?cè)谀行跃旱牟±碜兓邪l(fā)生了重要作用，在精子活動(dòng)能力低下和不育的男性病人的精子中存在更多的mtDNA基因缺失[8]。感染、不良生活習(xí)慣(如吸煙)和環(huán)境因素(如環(huán)境污染、輻射)等許多因素會(huì)增加ROS的生成。由于精索靜脈曲張病人的睪丸靜脈中白細(xì)胞DNA 8-OHdG的水平比外周靜脈中的水平高，從而睪丸經(jīng)脈中會(huì)產(chǎn)生更多的活性自由基[7]。

DNA對(duì)氧化損傷很敏感，精子的DNA遭受嚴(yán)重氧化損傷時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致不育[17-18]。精子的膜表面富含多聚不飽和脂肪酸，因此極易受到氧化損傷。過量的ROS會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而同時(shí)損傷精子的核DNA和mtDNA。

mtDNA的缺失可能會(huì)導(dǎo)致多重呼吸鏈的缺陷[2,17]。有缺陷的呼吸酶，包括由缺失的DNA片段編碼的蛋白亞基可能會(huì)促進(jìn)活性自由基的生成。mtDNA中缺失的4 977 bp片段中包括了多個(gè)編碼呼吸酶的基因，這些基因的缺失可能與精子活動(dòng)能力的降低和男性不育有關(guān)聯(lián)。精索靜脈曲張，同時(shí)ROS生成增加，會(huì)導(dǎo)致精子mtDNA的突變，最終導(dǎo)致不育。由于精索靜脈曲張恢復(fù)正常后，會(huì)促進(jìn)抗氧化劑的生成，并減少精子中的氧化應(yīng)激，從而可能會(huì)促進(jìn)男性的生育力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)精子mtDNA中4 977 bp片段的缺失與精索靜脈曲張導(dǎo)致的不育存在一定程度的相關(guān)。佐證了精子線粒體DNA片段缺失是精索靜脈曲張導(dǎo)致不育的一種重要因素。然而，尚需更大樣本量的研究來(lái)確認(rèn)精子mtDNA中4 977 bp片段的缺失與精索靜脈曲張導(dǎo)致的不育的關(guān)聯(lián)。