基于空間外差的三葉草拉曼特征光譜測量實驗研究

王新強, 葛浩然, 熊 偉, 葉 松, 王方原, 甘永瑩, 汪杰君, 李 樹*

1. 桂林電子科技大學(xué)， 廣西 桂林 541004 2. 中國科學(xué)院安徽光學(xué)精密機械研究所通用光學(xué)定標(biāo)與表征技術(shù)重點實驗室, 安徽 合肥 230031 3. 廣西光電信息處理重點實驗室， 廣西 桂林 541004

引 言

拉曼光譜(Raman spectroscopy, RS)一直以來都備受重視, 因為不同物質(zhì)的RS都能顯示其不同的特征， 例如物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、 振動歸屬、 結(jié)晶度等信息[1]。 RS在材料、 地質(zhì)探測、 血液分析、 深海環(huán)境等應(yīng)用廣泛[2-4]。 目前關(guān)于RS最新研究： 用RS分析法鑒定生咖啡豆的基因型、 識別咖啡豆感官質(zhì)量的化學(xué)變化[5]； 用RS快速篩選技術(shù)對受污染玉米中的玉米赤霉烯酮進行研究[6]； 連續(xù)石油焦的RS表征對焦炭形態(tài)的定量評估[7]； 用激光閃光RS法表征單個納米粒子的比熱[8]等。

由于拉曼信號較弱， 提取比較困難， 所以常用的方法是對樣品進行表面增強處理， 比較繁瑣。 近年來， 人們不斷嘗試用高分辨率的空間外差光譜儀(spatial heterodyne spectrometer, SHS)來探測RS。 2018年Allen等使用遠(yuǎn)程LIBS和拉曼SHS在10 m距離處測量各種樣品[9]； 2018年Qiu等用階梯鏡結(jié)構(gòu)開發(fā)空間外差拉曼光譜儀(spatial heterodyne Raman spectrometer, SHRS)， 并測量了巖石的RS[10]； 2017年Hu等利用SHS對化學(xué)戰(zhàn)劑模擬物進行RS檢測[11]。

三葉草是一種可食用的豆科草本植物, 外形優(yōu)美, 生命力頑強, 是綠化裝飾的佳品。 因其在牧草、 保健品、 醫(yī)學(xué)等方面的研發(fā)價值, 近年來人們越來越重視對三葉草的研究。 目前主要是研究三葉草的色素含量、 活力指數(shù)、 光合熒光特性等[12]在其他物質(zhì)影響下的變化， 以及在藥用功效: 抗炎、 愈合傷口等[13]。 而對三葉草RS的研究未見報道， 加之三葉草便于得到， 所以本文選擇三葉草進行初步試驗， 希翼有助于在保健食品、 醫(yī)學(xué)等方面的研究工作。

本文搭建了基于SHS的RS探測系統(tǒng), 不用對樣品做復(fù)雜處理, 能快速、 非接觸檢測拉曼信號。 首先介紹SHRS檢測原理, 接著是對三葉草里主要色素進行理論RS計算， 然后詳細(xì)說明實驗裝置與設(shè)計, 最后測出了三葉草的RS, 將理論RS與實測RS進行分析對比。 結(jié)果表明理論RS與實測RS可以很好的吻合， 證明拉曼探測系統(tǒng)的可行性。 最后分析了產(chǎn)生誤差和實測RS強度較弱的原因， 在接下來的工作將對測量系統(tǒng)進行改進， 進行基于SHRS的物質(zhì)含量定量測試。

1 空間外差拉曼光譜檢測原理

RS是一種散射光譜， 光照射到物體會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移， 進而會產(chǎn)生瑞利散射與拉曼散射。 若入射與散射光的頻率分別為ω0和ω1， 當(dāng)ω0=ω1則為彈性散射, 即瑞利散射。 若光子與分子間的能量相互傳遞，ω0會產(chǎn)生變化， 則為非彈性散射。 若hω0-hω1=hΔω, Δω的變化對應(yīng)于分子的轉(zhuǎn)動能級差, 這一過程稱為拉曼散射。 可以用能級理論來解釋， 如圖1中的紅色線和藍(lán)色線都是拉曼散射。

圖1 拉曼散射原理圖

其中紅色的稱斯托克斯譜線(Stokes), 即ω0>ω1

ΔE=hω0-hω1

(1)

藍(lán)色的又稱反Stokes譜線(anti-stokes), 即ω0<ω1

ΔE=hω1-hω0

(2)

通常情況下拉曼信號強度只有瑞利散射光強的千分之一， 信號微弱, 對于精確探測比較困難。 采用SHS作為光譜探測器， 具有超光譜分辨率、 高通量、 無運動部件等優(yōu)點， 能在被測物質(zhì)特征波長中心范圍探測， 實現(xiàn)微弱光信號的直接測量。 檢測原理如圖2所示， 樣品被激光器照射后， 產(chǎn)生拉曼散射光， 該散射光經(jīng)透鏡準(zhǔn)直， 由分束器分成兩束相干光， 兩相干光束分別被光柵G1, G2以θ角反向衍射回分束器重新合束， 兩合束光在出射面形成干涉條紋， 并由光學(xué)成像系統(tǒng)成像在探測器上， 最后對干涉數(shù)據(jù)進行傅里葉變換可處理出樣品的拉曼光譜。 由于SHS探測波段僅覆蓋RS強特征光譜范圍， 故可以避開瑞利散射光影響。

圖2 空間外差拉曼檢測原理圖

2 理論計算部分

SHS與普通光譜儀相比較， SHS更像是光譜儀中的放大鏡， 具有更窄的波段范圍和更高的光譜分辨率， 其光譜范圍一般只有十幾或幾個納米， 光譜分辨率可達10-4nm。 基于空間外差的RS測量系統(tǒng)測量時只針對目標(biāo)的最強特征峰進行探測， 因此獲取被測樣品RS譜峰信息對SHS參數(shù)設(shè)計與搭建具有指導(dǎo)作用。

理論RS仿真是通過使用Gaussview6.0搭建被測物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu), 利用Gaussian16[14]仿真出RS。 三葉草主要的光合色素是葉綠素和類胡蘿卜素[15]。 葉綠素包括葉綠素a與葉綠素b， 類胡蘿卜素由胡蘿卜素和葉黃素二大類組成。 葉片里類胡蘿卜素主要是α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素， 所以本文選擇仿真葉綠素a、 葉綠素b、 α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的RS。 它們含量從文獻[13]的含量圖可以算出， 葉綠素與類胡蘿卜素之比大致為10∶1。

首先搭建它們的分子結(jié)構(gòu)， 從圖3的優(yōu)化結(jié)構(gòu)可以看到, 葉綠素a和葉綠素b分子結(jié)構(gòu)的區(qū)別在其中一個吡咯環(huán)的附加基團上, 從圖3(a)和(b)的標(biāo)注可以看出, 分別是甲基與醛基。 類胡蘿卜素是異戊二烯類化合物, α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)的差異在于其中一個環(huán)己烷上的碳碳雙鍵位置不同， 如圖3(c)和(d)的標(biāo)注所示。 然后對搭好的分子構(gòu)型進行優(yōu)化, 最后進行頻率計算。 葉綠素分子中C， H和O元素選用DFT/B3LYP/6-31 G基組， Mg元素選用Lanl2DZ基組進行頻率計算。 類胡蘿卜素分子選用DFT/B3LYP/6-31+G(d, p)基組進行頻率計算。

優(yōu)化結(jié)構(gòu)圖如圖3所示, 所有分子計算后均沒有虛頻, 說明優(yōu)化的分子構(gòu)型很穩(wěn)定, 仿真結(jié)果可信。 修正[16]后的RS如圖4所示。 從圖4可以清晰的看出不同譜峰的強度大小， 從中選出最強譜峰附近的波段進行探測。 圖4(a)為葉綠素a的理論RS, 可以看出波數(shù)為1 662 cm-1時強度最大, 要測出其附近的四個峰, 即實測1 570～1 747 cm-1的波段。 圖4(b)是葉綠素b的理論RS, 選擇實測1 580～1 744 cm-1的峰段, 其中波數(shù)為1 640 cm-1時譜峰最強。 圖4(c)是α-胡蘿卜素的理論RS, 從圖中可以看出當(dāng)頻率為1 697 cm-1譜峰最強， 選擇測量1 663～16 97cm-1RS波段。 圖4(d)是β-胡蘿卜素的理論RS， 從圖中可以看出當(dāng)頻率為1 700 cm-1時， 譜峰最強， 選擇測量1 616～1 700 cm-1RS波段。 通過要測的仿真RS波段和SHS可測的光譜范圍， 可以反推出激光器的中心波長， 進而選擇合適的激光器， 下面的實驗部分會給出具體計算公式。

圖3 四種色素分子優(yōu)化結(jié)構(gòu)圖

3 實驗部分

搭建的物質(zhì)RS快速、 直接檢測系統(tǒng)， 是基于高分辨率的SHS, 將光譜范圍設(shè)計在近紅外, 可以有效的規(guī)避熒光； 由于SHS探測波段僅覆蓋RS強特征光譜范圍, 可以避開瑞利散射光。

圖5為物質(zhì)RS快速、 直接檢測系統(tǒng), 系統(tǒng)由空間外差拉曼探測單元與光譜數(shù)據(jù)提取單元兩部分組成, 其中空間外差拉曼探測單元包括激光器、 被測物、 高分辨率SHS。 光譜數(shù)據(jù)提取單元由計算機記錄干涉圖、 光譜提取組成。 具體的RS實測系統(tǒng)如圖6所示。 圖6中SHS是中國科學(xué)院安徽光學(xué)精密機械研究所設(shè)計的HEP-765-S, 光譜波段范圍為759～769 nm, 光譜分辨率優(yōu)于0.1 nm， 通光孔徑<30 nm， CCD探測器為CCD47-20AIMO(1 024×1 024)。

圖4 四種色素理仿真RS

圖5 物質(zhì)RS直接、 快速檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

圖6 實驗檢測系統(tǒng)圖

根據(jù)拉曼散射原理， 若SHS的光譜范圍為λ1～λ2, 頻率為σ1～σ2， 樣品的仿真RS較強的頻率段為σ3～σ4, 則激光器和被測物質(zhì)的頻率之差的絕對值應(yīng)該落在SHS的頻率范圍(σ1～σ2)內(nèi), 即滿足式(3)和式(4)

σ4=|σ0-σ1|

(3)

σ3=|σ0-σ2|

(4)

從圖4仿真RS光譜圖可以看出， 葉綠素a的較強波段為1 570～1 747 cm-1， 葉綠素b的較強RS波段為1 580～1 744 cm-1， α-胡蘿卜素較強RS波段為1 663～1 697 cm-1, β-胡蘿卜素較強RS波段為1 616～1 700 cm-1。 為了測量三葉草RS的較強拉曼波段, 需測出4種色素的較強波段。 利用式(3)和式(4)反推出激光器的中心波長， 選擇中心波長為680 nm的激光器較為合適。 因此本文采用了中心波長為680.28 nm的激光器作為激發(fā)光源， 最大功率為130 mW。

實驗前采摘三葉草， 清洗， 晾干。 測量時首先將三葉草固定在白板上, 讓激光器照射三葉草合適的位置， 確保激光器照射位置位于通光孔徑的中心。 接著設(shè)置采集的積分時間832 ms, 觸發(fā)時間2 s, 在黑暗條件下進行探測。 先不開激光器測量背景干涉圖， 然后打開激光器測量三葉草干涉圖。 最后對采集的干涉圖進行傅里葉變換， 預(yù)處理， 波長定標(biāo)， 最終得到三葉草的RS， 如圖7(a)所示。 激光器的電流強度為0.75 A, 室內(nèi)溫度為24 ℃。

4 結(jié)果與討論

利用搭建的物質(zhì)RS快速、 直接檢測系統(tǒng), 對三葉草進行初步試驗， 得到的RS如圖7(a)所示。 圖7(b)是理論仿真光譜圖， 按4種色素含量的比例， 將光譜強度進行調(diào)整， 最后擬合成一個光譜圖。 對比圖7(a)和(b)可以看出, 三葉草的實測RS是葉子內(nèi)各種色素的疊加包絡(luò)。 仿真圖7(b)里最左邊的譜峰(波數(shù)為1 550 cm-1)有上升趨勢， 與實驗圖7(a)譜峰上升的位置一致; 仿真圖7(b)中間波段(1 620～1 715 cm-1)的較高的譜峰所形成的包絡(luò)與實測光譜中間的凸起吻合較好。 仿真圖7(b)中最右邊1 750 cm-1的譜峰, 實驗圖中相對應(yīng)的位置有明顯下降的趨勢。 通過與仿真光譜比較， 實測光譜在使用空間外差系統(tǒng)探測波段正好是三葉草葉片內(nèi)主要色素RS信號疊加的包絡(luò), 中央主峰與兩端次峰都符合較好， 實測光譜與仿真光譜具有較好一致性， 說明采用空間外差系統(tǒng)對物質(zhì)拉曼信號進行直接檢測具有可行性。

圖7 (a) 實測RS, (b) 仿真RS合成圖,(c)實測的暗背景光譜

Fig.7 (a) Measured Raman spectrum, (b) Simulated Raman spectrum composite diagram, (c) Measured dark background spectrum

圖7(c)是實測的儀器暗背景光譜， 在一條緩慢上升的基線上疊加了一系列細(xì)脈沖信號， 這主要是由SHS探測器的熱噪聲構(gòu)成。 當(dāng)系統(tǒng)在探測到目標(biāo)拉曼信號后， 這些熱噪聲仍然存在， 但在快速傅里葉變換處理后強度有所減弱， 如圖7(a)中的小尖峰所示。 另一方面實測圖中拉曼信號強度總體較弱, 這主要是兩方面原因造成： 一是由于所用激光器的功率峰值偏小， 約為130 mW； 二是所用HEP-765-S空間外差光譜系統(tǒng)為一體化設(shè)計儀器， 軟硬件系統(tǒng)及參數(shù)固化后不能進行調(diào)整， 儀器數(shù)據(jù)采集的最大積分時間為832 ms。 光源功率不夠大且儀器積分時間小共同導(dǎo)致采集信號偏弱。

5 結(jié) 論

介紹了一種基于SHS的RS快速、 直接探測系統(tǒng)， SHS可測的光譜范圍為759～769 nm, 搭配不同的激光器, 可以實現(xiàn)同一目標(biāo)的不同波段RS或不同目標(biāo)的拉曼特征峰探測。 利用仿真出的RS， 得到物質(zhì)特征光譜， 也為激光器的選擇提供依據(jù)。 初步試驗是測量三葉草的RS， 首先理論計算了三葉草中的主要色素: 葉綠素a、 葉綠素b、 α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素理論RS， 接著根據(jù)SHS可測的光譜范圍和四種色素的理論RS較強特征波段, 選擇680.28nm的激光器作為激發(fā)光源， 最后實測出三葉草的RS。 結(jié)果表明實測圖與仿真圖很吻合， 證明了測量系統(tǒng)的可行性。 實驗中測量RS信號的強度稍弱， 這主要是兩方面原因造成： 一是由于所用激光器的輸出功率偏小， 約為130 mW； 二是由于使用的SHS系統(tǒng)積分時間不可調(diào)且積分時間短造成。 光源功率不夠大且儀器積分時間小共同導(dǎo)致采集信號偏弱。 后面我們將對測量系統(tǒng)進行改造或重新搭建， 進行基于SHRS的物質(zhì)含量定量測試。