用HPLC波長切換法同時測定甲氯霜中3種成分的含量

郝 哲，邱會蘋，張素娜，樊曉雷，王偉勤，屈 俊

(聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院藥劑科，鄭州 450042)

甲氯霜系聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院自制制劑，主要用于干性皮脂溢出癥、痤瘡、皰瘡等癥，療效頗佳。該制劑處方以甲硝唑、氯霉素為主藥，以羥苯乙酯為抑菌劑。甲硝唑為硝基咪唑衍生物，對大多數(shù)厭氧菌具有強大的抗菌作用[1]，但藥品不良反應(yīng)(ADRs)限制了其應(yīng)用。甲硝唑現(xiàn)多采用外用劑型，具有用量小、局部濃度高、作用持久、ADRs少、無全身給藥弊端等特點，且對皮膚無刺激性[2]。氯霉素局部外用可減少或抑制痤瘡棒狀桿菌，減輕炎癥反應(yīng)[3]。羥苯乙酯為尼泊金酯類防腐劑，具有廣譜抑菌作用，常用于食品、藥品和化妝品中[4]。人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)明確提出應(yīng)建立抑菌劑含量測定方法[5]。若藥物制劑中抑菌劑用量不足，便達(dá)不到有效抑菌濃度，而用量過大，則具有一定毒性，易引起ADRs[6]。近年來，人們越來越重視制劑中羥苯乙酯的含量控制。雖已有文獻(xiàn)[7-8]報道其他制劑中甲硝唑、氯霉素的含量測定方法，但均為單波長法。本研究首次采用HPLC波長切換法同時測定甲氯霜中甲硝唑、氯霉素及羥苯乙酯3種成分的含量，該方法簡便、快速，可為甲氯霜制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 島津LC-10A高效液相色譜儀(包括SPD-10A 紫外檢測器和LC-solution Lite色譜工作站，日本島津公司)；BT-125D型電子天平(精度0.01 mg/0.1 mg，稱量范圍41 g/120 g，德國賽多利斯有限公司)；AS3120A 型超聲波清洗器(天津Auto-science公司)；Wondasil C18色譜柱(日本島津公司)。

1.2 藥品和試劑 甲硝唑?qū)φ掌?純度99.9%，批號100191-201507)、氯霉素對照品(純度99.8%，批號130555-201704)、羥苯乙酯對照品(純度99.9%，批號100847-201604，中國食品藥品檢定研究院)。甲氯霜(規(guī)格30 g/支，批號180911、180912、180913)和陰性樣品均為本院自制；水為自制蒸餾水；甲醇(色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Wondasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)和0.5%冰乙酸溶液(B)，梯度洗脫：0～8 min 35%A，8～16 min 35%～45%A，16～30 min 45%～60%A；柱溫為40 ℃。檢測波長：0～8 min在320 nm處檢測甲硝唑，8～16 min在278 nm處檢測氯霉素，16～30 min在254 nm處檢測羥苯乙酯。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取甲硝唑?qū)φ掌?.68 mg和氯霉素對照品9.58 mg置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液1。精密稱取羥苯乙酯對照品11.72 mg置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液2；再精密量取1 ml對照品儲備液2置25 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液3。分別精密量取對照品儲備液1和對照品儲備液3各3 ml置10 ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 另取甲氯霜約0.5 g，精密稱定，置燒杯中，加乙醇約30 ml，置80 ℃水浴中加熱2 min，振搖使溶解，轉(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，放冷至室溫，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷卻3 h，取出后迅速濾過，續(xù)濾液放至室溫，再精密量取3 ml置10 ml量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 根據(jù)處方中藥物的比例，按相關(guān)工藝制備不含甲硝唑、氯霉素和羥苯乙酯的陰性樣品，再按2.2.2項下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗 分別取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μl注入HPLC儀，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。由圖1可見，各主成分分離度好，陰性樣品在3種成分相應(yīng)位置上無吸收，表明陰性無干擾。

圖1 甲氯霜的HPLC譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of Jialv creamA:混合對照品溶液;B:供試品溶液;C:陰性樣品溶液；1：甲硝唑;2：氯霉素;3：羥苯乙酯

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項下對照品儲備液1和對照品儲備液3各2、2.5、3、3.5、4 ml置10 ml量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，分別吸取10 μl注入色譜儀，按2.1項下色譜條件測定。以對照品的質(zhì)量濃度(c，單位μg/ml)為橫坐標(biāo)，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到甲硝唑、氯霉素及羥苯乙酯的回歸方程分別為A甲硝唑=3.01×104c+3.28×103(r=0.999 9)，線性范圍38.68～77.36 μg/ml；A氯霉素=1.91 ×104c-6.19×103(r=0.999 9)，線性范圍38.24～76.49 μg/ml；A羥苯乙酯=7.86×104c+4.78×102(r=0.999 9)，線性范圍1.87～3.75 μg/ml。結(jié)果表明，3種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實驗 吸取2.2.1項下混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μl，測定其峰面積并計算RSD值。結(jié)果甲硝唑、氯霉素及羥苯乙酯峰面積的RSD值分別為0.73%、0.97%、1.02%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗 精密稱取6份樣品(批號180911)各0.5 g，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果甲硝唑、氯霉素及羥苯乙酯峰面積的RSD值分別為1.01%、0.93%和1.11%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗 取2.6項下1號供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣10 μl，測定峰面積并計算RSD值。結(jié)果甲硝唑、氯霉素及羥苯乙酯峰面積的RSD值分別為1.03%、0.98%、1.11%(n=5)，表明供試品溶液在配制后12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品9份(批號180911)，每份約0.25 g，按照樣品中各成分含量的80%、100%、120%分別精密加入相應(yīng)對照品(甲硝唑?qū)φ掌啡芤簼舛葹?.065 mg/ml，氯霉素對照品溶液濃度為1.004 mg/ml，羥苯乙酯對照品溶液濃度為0.234 2 mg/ml )，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1項下色譜條件測定，計算平均回收率。結(jié)果甲硝唑、氯霉素和羥苯乙酯的平均回收率分別為(99.4±0.4)%、(99.3±0.8)%、(98.9±0.4)%(n=9)。

2.9 樣品含量測定 分別取3批樣品，每批3份，精密稱定，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行含量測定，以外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表1。

表1 甲氯霜中甲硝唑、氯霉素和羥苯乙酯含量測定結(jié)果
Table 1 Determination results of the components of
metronidazole,chloramphenicol and
ethylparaben in Jialv cream

批號甲硝唑氯霉素羥苯乙酯18091119.44±0.1018.07±0.050.92±0.0118091219.41±0.2118.30±0.150.97±0.0118091319.18±0.1517.71±0.190.97±0.01

2.10 含量限度確定 本處方中甲硝唑和氯霉素的理論含量均為18.8 mg/g，羥苯乙酯理論含量為1 mg/g，取其標(biāo)示量的90.0%～110.0%為含量限度，即得甲硝唑和氯霉素的含量限度均為16.9～20.6 mg/g，羥苯乙酯的含量限度為0.9～1.1 mg/g。本研究所測含量結(jié)果均在此范圍內(nèi)。

3 討 論

3.1 提取溶劑的選擇 作者曾比較了甲醇、乙醇兩種提取溶劑，結(jié)果兩者提取的樣品冰浴后，基質(zhì)均無明顯析出，但乙醇提取的樣品中3種藥品含量均略高且雜質(zhì)峰面積較小，故選擇乙醇為提取溶劑。另在提取過程中，瓶底部有少許黃色團狀物，其為升華硫，在濾過中除去，不影響含量測定。

3.2 冰浴時間的考察 預(yù)實驗中曾考察了冰浴1、2、3、4 h對提取效果的影響。結(jié)果冰浴3 h與4 h藥品含量基本一致，表明冰浴3 h即可將有效成分提取完全，故選擇冰浴3 h。

3.3 流動相的選擇 本研究曾考察甲醇-乙腈-水(50∶5∶45)[7]體系作為流動相，但羥苯乙酯峰保留時間為33 min，出峰時間較遲；又考察了甲醇-水(68∶32)[8]體系，氯霉素峰拖尾嚴(yán)重；后嘗試甲醇-0.1%冰乙酸溶液與甲醇-0.5%冰乙酸溶液體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-0.5%冰乙酸溶液體系比甲醇-0.1%冰乙酸溶液體系分離效果好，三者峰形尖銳，拖尾因子符合要求，且均達(dá)到基線分離，在25 min內(nèi)即可完成含量測定，故選擇甲醇-0.5%冰乙酸溶液體系作為流動相。

3.4 檢測波長的選擇 將甲硝唑、氯霉素和羥苯乙酯3種對照品儲備液用流動相稀釋后在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果甲硝唑、氯霉素、羥苯乙酯的最大吸收波長分別為320、278、256 nm，三者吸收波長差異較大，因此選擇波長切換法分別在各自吸收峰值處測定其含量。

3.5 柱溫的選擇 本研究曾比較了柱溫為25 ℃、30 ℃和40 ℃條件下的樣品分離情況，發(fā)現(xiàn)柱溫為25 ℃和30 ℃時，樣品分離效果不好，重現(xiàn)性較差，而柱溫為40 ℃時，樣品各成分峰形對稱，均達(dá)到基線分離，且重復(fù)性好，故選擇柱溫為40 ℃。