單針藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及生物酶油脂萃取研究

劉 偉，林偉國(guó)，曾建立，榮峻峰

(中國(guó)石化石油化工科學(xué)研究院，北京 100083)

單針藻屬于綠藻門單針藻屬，細(xì)胞為不規(guī)則的紡錘形，寬4～8 μm，長(zhǎng)12～26 μm。單針藻能夠利用無機(jī)碳和廢氣中CO2進(jìn)行光合作用自養(yǎng)生長(zhǎng)，也可以有機(jī)碳為碳源異養(yǎng)及混養(yǎng)生長(zhǎng)，而且有機(jī)碳為碳源時(shí)的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于無機(jī)碳源的自養(yǎng)生長(zhǎng)[1]。單針藻生長(zhǎng)速率快、油脂含量高，在氮、磷缺乏的條件下油脂含量超過50%[2]。油脂中C16和C18短鏈脂肪酸酯總量可達(dá)95%，其中C18單不飽和脂肪酸酯含量超過30%，是生物柴油生產(chǎn)的潛在原料之一[3]。單針藻可以用于污水和廢氣的處理，去除有毒酚類物質(zhì)[4]。利用污水和廢水培養(yǎng)單針藻，不僅能夠凈化污水及空氣，還可以利用其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降低培養(yǎng)成本[5-6]。

將單針藻中的油脂有效、經(jīng)濟(jì)地萃取出來是發(fā)揮其潛力的關(guān)鍵技術(shù)之一[7]。微藻油脂的萃取通常是先對(duì)細(xì)胞破壁，然后采用物理壓榨法、溶劑法或者超臨界CO2法萃取[8-10]。酶解萃取法技術(shù)是采用對(duì)細(xì)胞組織及脂多糖、脂蛋白等復(fù)合體有降解作用的酶處理微藻，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破壁，并對(duì)脂蛋白、脂多糖分解，增加微藻中油脂在萃取劑中的流動(dòng)性，促使油脂萃取出來。酶解法工藝條件溫和，降解產(chǎn)物一般不會(huì)與萃取物發(fā)生反應(yīng)，可以有效地保護(hù)油脂、蛋白質(zhì)以及膠質(zhì)等可利用成分的品質(zhì)。在得到油的同時(shí)有利于回收微藻中的蛋白質(zhì)及多糖等。酶解法操作能耗低，提取的油純度高，磷脂含量、酸值及過氧化值低，色澤淺，廢水中BOD與COD低，易于處理，污染少，符合“安全、高效、綠色”的要求[11-13]。

目前，用于單針藻油脂的萃取大多是Bligh-Dyer法[14-16]或其改進(jìn)方法[17-18]，萃取前或萃取過程中通過超聲波實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破壁[19]。本課題利用酶解法對(duì)自制的單針藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)及油脂萃取進(jìn)行研究。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料及試劑

單針藻，中國(guó)石化石家莊煉化分公司微藻養(yǎng)殖示范基地養(yǎng)殖，藻種由中國(guó)科學(xué)院武漢植物園提供，培養(yǎng)基為BG11，碳源為煉油廠制氫尾氣中的二氧化碳;醋酸、鹽酸、甲醇、乙醇、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三氯甲烷、正己烷，均為分析純，由北京化工廠生產(chǎn)； 溶菌酶，20 000 IU/g，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶，2 000 IU/g，果膠酶，20 000 IU/g，酸性蛋白酶，50 000 IU/g，購(gòu)于北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SG23 pH測(cè)定儀，由梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產(chǎn)；3-15 sigma離心機(jī)，由Sigma公司生產(chǎn)；SCT-06 Soxhlet提取器，由杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；JEM-1200EX透射電子顯微鏡，由日本電子公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單針藻油脂理論含量單針藻油脂理論含量按Soxhlet萃取法[20]萃取結(jié)果計(jì)。取一定量單針藻在105 ℃下干燥2 h、研磨，在Soxhlet 萃取器中萃取至萃取劑無油跡為止。回收萃取劑，萃取瓶在105 ℃下干燥至恒重，萃取瓶增加的量計(jì)為單針藻油脂質(zhì)量。萃取劑分別為正己烷和三氯甲烷甲醇混合液(體積比2∶1)。單針藻油脂理論含量(w)按式(1)計(jì)算。

w=W1W×100%

(1)

式中：W1為油脂質(zhì)量，g；W為單針藻質(zhì)量，g。

1.3.2 單針藻的超微結(jié)構(gòu)單針藻冷凍切片，然后通過透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。透射電鏡樣品首先用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛水溶液固定后離心，用0.2 mgL 的瓊脂包埋，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸水溶液固定，用磷酸緩沖液沖洗、系列乙醇丙酮水溶液脫水、Spurr樹脂包埋、ReichertJung E超薄切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后觀察、拍照[21-23]。

1.3.3 酶解萃取油脂稱取定量的單針藻干粉加入三口燒瓶中，加入適量水，攪拌均勻，水浴加熱。按照200 IUg(藻)的量加入生物酶，50 ℃下酶解12 h。然后，加入計(jì)量的萃取劑常溫下萃取1～3次，每次30 min。萃取液在離心機(jī)中于轉(zhuǎn)速8 000 rmin下離心分離10 min。離心后置下層溶液到預(yù)先稱重的燒杯中。待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，把燒杯放入烘箱，60 ℃下干燥1.5 h。燒杯冷卻后稱量，按式(2)計(jì)算油脂收率(y)。

y=(m2-m1)m0×100%

(2)

式中：m0為單針藻樣品質(zhì)量，g；m1為燒杯質(zhì)量，g；m2為含油脂燒杯質(zhì)量，g。

單針藻油脂的萃取率(z)按式(3)計(jì)算。

z=yw×100%

(3)

1.3.4 單針藻油脂分析皂化物和不皂化物：按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBT 5535.2—2008《動(dòng)植物油脂 不皂化物測(cè)定 第2部分：己烷提取法》，先用KOH乙醇(95%)溶液皂化萃取的油脂，然后用正己烷萃取分離不皂化物。再通過鹽酸滴定確定皂化物含量[24]，稱量正己烷萃取物量，計(jì)算得到不皂化物量。

脂肪酸組成：先將油脂甲酯化，然后用正己烷萃取收集脂肪酸，經(jīng)GC-MS分析確定其成分[15]。判斷微藻油脂作為生物柴油原料的參數(shù)為不飽和度[25]，按式(4)計(jì)算。

DU=MU+2(PU)

(4)

式中：DU為脂肪酸不飽和度，%；MU為單不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；PU為多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 單針藻油脂理論含量

Soxhlet法通常是在萃取劑沸點(diǎn)下回流，即萃取過程始終為新鮮純凈的冷凝液淋洗、浸泡，保證了濃度梯度最大，溶解擴(kuò)散速率最快。加上時(shí)間較長(zhǎng)，萃取更充分，油脂收率更高。Soxhlet法可以作為油脂萃取的基本方法，將其萃取得到的油脂含量當(dāng)作微藻的理論油脂含量，與其他油脂萃取法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。正己烷和三氯甲烷甲醇混合液萃取單針藻的油脂理論含量分別為15.20%和30.04%，萃取時(shí)間為10 h。

2.2 單針藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

單針藻是具有單層或多層細(xì)胞壁的浮游植物。單針藻的超微結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中，圖1(b)和圖1(c)分別為單針藻的縱向剖面照片和橫向剖面照片，圖1(d)則顯示單針藻處于分裂狀態(tài)。從圖1可以看出，單針藻呈橢圓形，邊緣光滑，無鞭毛，具有明顯的單細(xì)胞特征。橫向剖面顯示出多層細(xì)胞壁，細(xì)胞壁厚度約50 nm，細(xì)胞核處于細(xì)胞的前部，具有多個(gè)細(xì)胞器?？v向剖面顯示，細(xì)胞器主要集中在細(xì)胞的一側(cè)，另一側(cè)多為類囊體和葉綠素。而細(xì)胞分裂時(shí)，邊緣變的褶皺不平，存在更多的突起，表現(xiàn)為非等分分裂。

圖1 單針藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

通常藻類細(xì)胞壁包括內(nèi)外層，其中外層是主要由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、藻酸鹽、藻多糖和聚半乳糖硫酸酯等多層微纖絲組成的多孔結(jié)構(gòu)，內(nèi)層主要成分是纖維素和半纖維素。此外，細(xì)胞外壁還富含藻細(xì)胞釋放的以多肽、多糖為主的胞外產(chǎn)物。

生物酶對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有特定的降解作用。表1為纖維素酶和復(fù)合酶(纖維素酶+果膠酶+蛋白酶+溶菌酶B)分別酶解單針藻后油脂萃取結(jié)果。從表1可以看出，纖維素酶酶解可以顯著提高油脂收率，說明纖維素酶破壞了存在纖維素和半纖維素的單針藻的細(xì)胞壁。但加入含有其他生物酶的復(fù)合酶酶解后，油脂收率和纖維素酶酶解結(jié)果相差無幾，說明單針藻細(xì)胞壁內(nèi)外層主要由纖維素和半纖維素組成。

表1 生物酶對(duì)單針藻油脂萃取率的影響

注：萃取劑為三氯甲烷。

2.3 油脂萃取

微藻中的油脂是一種成分復(fù)雜的混合物，包括三酸甘油酯、二酸甘油酯、單酸甘油酯、類固醇等和游離脂肪酸、磷脂、鞘酯等。其中甘油酸酯和游離脂肪酸通過甲醇酯化可以形成脂肪酸甲酯，制備生物柴油。磷脂和類固醇等可以作為保健品和藥品的原料，具有極高的價(jià)值。因此，除盡可能多地提取微藻中的甘油酸酯和游離脂肪酸之外，對(duì)微藻中的其他成分也應(yīng)加以利用，產(chǎn)生更多的經(jīng)濟(jì)效益，降低微藻生產(chǎn)生物柴油的成本。

單針藻具有多層纖維素和半纖維素質(zhì)的細(xì)胞壁。要將單針藻中的油脂從細(xì)胞中高效地分離出來，首先應(yīng)該破壞細(xì)胞壁(破壁)，使得萃取劑易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部?？紤]到能量消耗，破壁可以完全破壞也可以產(chǎn)生裂縫的部分破壞。但破壁越徹底，也越容易產(chǎn)生更多的細(xì)粉，給后續(xù)分離帶來困難。其次，考慮萃取劑對(duì)油脂的溶解能力以及油脂表面環(huán)境影響，優(yōu)化或強(qiáng)化萃取劑極性或非極性實(shí)現(xiàn)選擇性的油脂萃取。再次，萃取油脂在萃取體系中的濃度梯度，濃度梯度越大，擴(kuò)散速率越快，萃取效率也越高。

2.3.1 堿預(yù)處理對(duì)單針藻油脂萃取的影響在微藻液中，堿的加入可以調(diào)節(jié)體系的pH、改變?cè)寮?xì)胞壁內(nèi)外化學(xué)環(huán)境、軟化或降解纖維素等。堿預(yù)處理?xiàng)l件為：用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到9，在80 ℃反應(yīng)8 h，然后用醋酸調(diào)節(jié)pH到5。其對(duì)單針藻油脂萃取效果的影響見表2。從表2可以看出，堿預(yù)處理后，單針藻油脂收率可以提高10%以上。因此以下所有試驗(yàn)均經(jīng)過堿預(yù)處理。

表2 堿處理對(duì)單針藻油脂萃取率的影響

注：溶劑為三氯甲烷。

2.3.2 助溶劑的影響依據(jù)“相似相容”的原理，微藻油脂的萃取效果與萃取劑的極性有很大關(guān)系。在油脂萃取劑中，正己烷、三氯甲烷和乙醇的極性依次增加。極性溶劑更有利于萃取極性油脂，非極性溶劑更利于非極性油脂的萃取。但細(xì)胞內(nèi)部通常含有一定量的水分，附著在油脂表面、甚至包裹油脂。強(qiáng)極性的水會(huì)阻隔或者影響萃取劑的溶解。因此，在微藻油脂萃取的過程中，與水互溶性較差的有機(jī)溶劑作為萃取劑不利于微藻油脂的溶解。加入極性助溶劑有助于萃取劑與水相的有效浸潤(rùn)、接觸和油脂萃取率的提高。助溶劑乙醇對(duì)單針藻油脂萃取效果的影響見表3。

表3 助溶劑對(duì)單針藻油脂萃取率的影響

注：纖維素酶酶解，雙組分萃取劑體積比為1∶1。

從表3可以看出，正己烷的油脂收率較三氯甲烷更小，即正己烷萃取物中更偏重于極性更小的油脂。加入極性更強(qiáng)的助溶劑乙醇后，雙組分的萃取劑體系對(duì)單針藻的油脂收率均有所提高。

2.3.3 萃取次數(shù)的影響微藻油脂萃取時(shí)，萃取劑首先穿過細(xì)胞壁擴(kuò)散到油脂表面，溶解油脂，形成表面含油脂萃取液。然后含油脂萃取液經(jīng)過細(xì)胞壁向萃取劑主體擴(kuò)散，擴(kuò)散速率取決于表面萃取液油脂濃度和主體萃取劑含油脂濃度差。萃取開始時(shí)，萃取劑主體油脂濃度為零，此時(shí)濃度差最大，擴(kuò)散速率最快。隨著萃取的進(jìn)行，萃取劑主體油脂濃度增加，濃度差越來越小，擴(kuò)散速率越來越慢，萃取效率也不斷降低。增加萃取次數(shù)將提高油脂收率，即萃取一定時(shí)間后，過濾分離，分離后的微藻加入新鮮萃取劑在同樣的條件下繼續(xù)萃取，結(jié)果如圖2所示。

圖2 萃取次數(shù)對(duì)油脂收率和萃取率的影響溶劑為正己烷乙醇。■—油脂收率； ●—萃取率

從圖2可以看出，隨著萃取次數(shù)的增加，單針藻油脂收率和萃取率先快速增加，然后趨于平緩。萃取3次后，油脂萃取率即可超過80%。考慮到萃取劑的使用量、萃取時(shí)間等因素，萃取次數(shù)一般以不超過3次為宜。

2.4 單針藻油脂分析

2.4.1 皂化物和不皂化物表4為不同萃取劑萃取得到的油脂中皂化物和不皂化物含量。從表4可以看出，三氯甲烷萃取油脂收率較高，但油脂中皂化物含量則較低。說明極性更強(qiáng)的三氯甲烷萃取了更多的不皂化物。而以正己烷為萃取劑萃取的油脂含有更多的中性脂，皂化物含量更高，更適宜于生物柴油的制備。而不皂化物中含有高級(jí)脂肪醇、甾醇、色素及生育酚等高附加值成分，即極性更強(qiáng)的萃取劑萃取更有利于提高單針藻油脂的綜合價(jià)值。

表4 不同溶劑萃取的微藻油脂收率及皂化物含量

2.4.2 油脂中脂肪酸成分脂肪酸的組成特別是碳鏈長(zhǎng)度和不飽和脂肪酸含量對(duì)于能否適合制備生物柴油以及制備的生物柴油性質(zhì)有重要影響。碳鏈越長(zhǎng)、飽和脂肪酸含量越多，十六烷值越高。表5為單針藻油脂經(jīng)過甲酯化后得到的脂肪酸的組成。

表5 單針藻油脂中的脂肪酸組成 w，%

從表5可以看出，單針藻油脂包含的脂肪酸種類較多，主要成分是棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、十八碳烯酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)及亞麻酸(C18∶3)等，其中C18∶1含量最高。因此，用于制備生物柴油，單針藻油脂會(huì)改善生物柴油低溫流動(dòng)性，有效降低多不飽和脂肪酸的易氧化性。同時(shí)，較高的C16∶0和C18∶1含量可降低不飽和度，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和達(dá)71.59%，不飽和度為97.20%，比較適于制備生物柴油。另外，單針藻油脂還含有一定量C20以上的長(zhǎng)鏈脂肪酸，這些物質(zhì)是普通動(dòng)植物油脂不能提供的對(duì)人體健康有益的成分。

3 結(jié) 論

(1)單針藻具有明顯的單細(xì)胞特征，細(xì)胞壁主要由纖維素和半纖維素組成，壁厚大約50 nm。

(2)纖維素酶酶解可以實(shí)現(xiàn)單針藻細(xì)胞的破壁。酶解法可以在較低的溫度下萃取單針藻油脂，油脂收率大于13%，萃取率可達(dá)80%以上。

(3)單針藻油脂中脂肪酸主要由C16～C22組成，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和達(dá)71.59%，不飽和度為97.20%，顯示單針藻油脂可以用于制備生物柴油。