一株黑枸杞內(nèi)生真菌紅色素提取工藝及其穩(wěn)定性分析

韋冠宇，楊小朵，李松澄，鄭敬暉，藍(lán)秋菊，劉俊林*

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730110）

色素在日常生活和科研等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用，由于合成色素的問題越來越來受到人們的關(guān)注，因此安全性高、具有一定藥用價(jià)值天然色素日益受到人們的認(rèn)可[1-2]。

微生物色素作為天然色素不受限制，與其他色素具有不可比擬的優(yōu)越性[3]。天然色素一般穩(wěn)定性較差，對(duì)溫度、pH、氧化劑、添加劑、金屬離子、添加劑等因素非常敏感，其穩(wěn)定性會(huì)隨著環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變[4]，色素的穩(wěn)定性在一定程度上決定了其應(yīng)用范圍，由此可知色素穩(wěn)定性的研究具有非常重要的意義。本文以一株產(chǎn)紅色素枸黑枸杞內(nèi)生真菌G根7為對(duì)研究對(duì)象并產(chǎn)生紅色素的穩(wěn)定性進(jìn)行一系列探究，為該色素進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 產(chǎn)紅色素菌株

內(nèi)生真菌G根7，由西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室從黑枸杞植株根部分離獲得純化后加入無菌甘油后置于-80℃條件下保存。

1.1.2 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基,北京索萊寶（Solar-bio）科技有限公司;葡萄糖、瓊脂粉、無水乙醇、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

1.1.3 儀器

Nano-drop 1000-UV型分光光度計(jì)，日本島津公司；MaxQ436大型落地式恒溫?fù)u床，美國Thermofish ；HWS型智能恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色素的提取

將保存的菌株用接菌環(huán)挑取菌絲接于PDA平板培養(yǎng)基活化，待培養(yǎng)基中色素含量飽和后，將菌絲與培養(yǎng)基分離，棄菌絲留含色素的培養(yǎng)基，將其培養(yǎng)基破碎后浸泡在蒸餾水中，料液比為質(zhì)量：體積＝1：10，1500r/min置于搖床振蕩24h[1]，過濾取上層色素清液，濃縮至30～50ml,真空干燥得粗色素提取物，去離子水稀釋至1mg/mL備用。

1.2.2 色素吸收光譜曲線的測定

取上述1mg/mL紅色素提取液5mL置于比色皿中，以蒸餾水作為對(duì)照組，用Nano-drop 1000-UV型分光光度計(jì)在波長為320～580nm間進(jìn)行吸光值測定，以10nm為間隔進(jìn)行掃描記錄數(shù)據(jù)，重復(fù)測量3次取其平均值繪制光譜曲線，觀察光譜特征，分析確定其最大吸收峰值。

1.2.3 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性影響

取50mL濃度為1mg/mL色素溶液置于100mL錐形瓶中，分別于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃恒溫水浴條件下、保溫1h[6]，將其迅速冷卻至常溫觀察顏色變化，以蒸餾水為對(duì)照分別測定各條件下最大吸收波長處的吸光值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取其平均值，分析其在20～100℃溫度范圍內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.4 p H對(duì)色素穩(wěn)定性影響

取5mL濃度為1mg/mL色素溶液，色素溶液與酸堿試劑以3︰1的比例，對(duì)照組色素溶液與蒸餾水以3︰1的比例，分別與pH=2、pH=4、pH=6、pH=8、pH=10、pH=12的酸堿試劑分混勻靜置1h后，于分光光度計(jì)下分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，重復(fù)測量3次取其平均值, 分析不同pH值對(duì)色素穩(wěn)定性。

1.2.5 不同濃度氧化劑對(duì)色素穩(wěn)定性影響

取5mL濃度為1mg/mL色素提取溶液，分別加入3mL濃度為 0mg/mL、0.2 mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0 mg/mL的氧化劑H2O2、Na2SO3溶液，對(duì)照組色素溶液加入蒸餾水3mL混合均勻后，觀察溶液顏色變化并于分光光度計(jì)下測定其最大吸光值，重復(fù)測量3次取其平均值，分析比較其在各氧化劑溶液中的穩(wěn)定性。

1.2.6 金屬離子對(duì)色素的穩(wěn)定性影響

取5mL濃度為1mg/mL色素提取溶液，分別加入含有3mL濃 度 為 0.5mg/mL 含 有 Ca2+、K+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Pb2+的金屬離子水溶液（溶液中只含一種金屬離子），對(duì)照組色素溶液加入蒸餾水3mL混合均勻后,室溫下靜置1h后觀察溶液顏色變化，并于分光光度計(jì)下測定其最大吸光值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取其平均值。分析比較其在各金屬離子溶液中的穩(wěn)定性。

1.2.7 不同添加劑對(duì)色素的影響

取5mL濃度為1mg/mL色素提取溶液，分別加入含有3mL濃度為0.5mg/mL含有山梨醇、淀粉、酒石酸鉀鈉、檸檬酸、葡萄糖、蔗糖、乳糖的水溶液，對(duì)照組色素溶液加入蒸餾水3mL混合均勻后,室溫下靜置1h后觀察溶液顏色變化，并于分光光度計(jì)下測定其最大吸光值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取其平均值，分析比較其在不同添加劑溶液中的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)紅色素內(nèi)生真菌G根7菌株及色素提取液

圖 1 菌株正面

圖 2 菌株背面

圖 3 色素提取液

2.2 色素特征吸收光譜曲線

圖4 為紅色素在320～580nm(每隔10nm測量一次)范圍內(nèi)用可見分光光度計(jì)測試形成的圖譜。圖可知該色素在可見光范圍內(nèi)有2個(gè)吸收峰，最大吸收峰為390nm其對(duì)應(yīng)的最大吸光度值為1.04。

圖4色素特征吸收光譜曲線

2.3 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性影響結(jié)果

圖5 所示，該色素在20～100℃溫度范圍內(nèi)能存在,在該溫度范圍內(nèi)處理后，觀察顏色無太大變化，再將其置于可見分光光度計(jì)下測定其吸光值，發(fā)現(xiàn)在溫度在達(dá)到60℃之后，該色素的吸光值有較為明顯的下降，證明該色素不耐高溫。

圖5 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性影響

2.4 pH對(duì)色素穩(wěn)定性影響

如圖6所示，該色素在pH=2～12范圍內(nèi)能穩(wěn)定存在,在pH=2～12 范圍內(nèi)作用后發(fā)現(xiàn)顏色無明顯變化，將其放置于可見分光光度計(jì)下測定其吸光值，測量結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH=4～8時(shí)，色素出現(xiàn)較為明顯的增色效應(yīng)，且無明顯的化學(xué)反應(yīng)發(fā)生。說明該紅色素在一定酸堿條件下能穩(wěn)定存在，便于實(shí)際生活中應(yīng)用，由測量結(jié)果可知該色素在酸性條件下的增色作用強(qiáng)于堿性條件。

圖6 不同pH值對(duì)色素穩(wěn)定性影響

2.5 不同濃度氧化劑對(duì)色素穩(wěn)定性影響

由圖7顯示氧化劑對(duì)該紅色素的影響比較大，不同濃度的氧化劑的該紅色素的作用不同，結(jié)果表明0.8mg/mLNa2SO3溶液對(duì)該色素色澤有明顯的增強(qiáng)作用，并且Na2SO3溶液的護(hù)色作用強(qiáng)于 H2O2溶液。

圖7 不同濃度氧化劑對(duì)色素穩(wěn)定性影響

2.6 金屬離子對(duì)色素的穩(wěn)定性影響

由 圖 7 可 知 該 紅 色 素 在 Ca2+、K+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Pb2+的金屬離子水溶液中能穩(wěn)定存在，但各離子對(duì)色素的作用效果不盡相同。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Fe2+和Al3+對(duì)該色素有明顯的護(hù)色作用。

圖8 金屬離子對(duì)色素的穩(wěn)定性影響

2.7 不同添加劑對(duì)色素的影響

由圖8可只在實(shí)驗(yàn)中所加人的不同添加劑中，淀粉對(duì)該紅色素的的護(hù)色有明顯的增強(qiáng)作用，在波長390nm的條件下測得的吸光值為1.435，是其他添加劑的3.5倍。猜想該色素有良好的染色作用，可用于一些紡織品的染色。

圖9 不同添加劑對(duì)色素的影響

3 結(jié)論與展望

本研究在黑枸杞根部中分離出一株產(chǎn)紅色素的內(nèi)生真菌G根7，通過PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生紅色素，且該色素為水溶性色素，便于提取分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該色素在20℃～100℃的條件下穩(wěn)定存在，在一定范圍內(nèi)不必?fù)?dān)心因溫度問題而造成色素品質(zhì)下降。在p H=4～8時(shí)，色素出現(xiàn)較為明顯的增色效應(yīng)，且無明顯的化學(xué)反應(yīng)發(fā)生。在生產(chǎn)實(shí)踐中可適量加入亞硫酸鈉以提高色素品質(zhì)，使顏色更鮮艷。金屬離子Fe2+、Al3+對(duì)該色素都有明顯增色作用，在非食品實(shí)際生產(chǎn)中可適量加入其中之一[5]，提高產(chǎn)品色澤。本文所提取的紅色素是藥用植物枸杞內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物，其與枸杞長期共生可能產(chǎn)生與之具有相同或相似作用的活性物質(zhì)[6]，筆者猜想可用于抗氧化、抗衰老、抗菌等方面的保健品或藥品的研究。但該色素在純化處理、理化性質(zhì)、基本結(jié)構(gòu)，食用安全上還有待進(jìn)一步的深入研究，以期為化妝品、食品行業(yè)等做出一定的貢獻(xiàn)[7]。