超聲輔助復(fù)合酶法制備碎米多孔淀粉及結(jié)構(gòu)比較

吳麗榮 葉興乾 田金虎 張惠玲

(寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室；寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院1，銀川 750021)

(智能食品加工技術(shù)與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室；浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室；浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院2,杭州 310058)

淀粉是自然界中最豐富的碳水化合物之一，因其可再生性、低成本以及對環(huán)境壓力較小而被廣泛應(yīng)用于造紙、紡織和食品等領(lǐng)域[1]。然而，天然淀粉小的表面積和孔體積等特性很少能滿足食品和工業(yè)生產(chǎn)所需的特定物理化學(xué)性質(zhì)[2, 3]。多孔淀粉作為一種具有高孔隙量、高比表面積及良好吸附性和分散性的改性淀粉可以滿足許多工業(yè)食品的需求，因而備受關(guān)注[4,5]。例如，多孔淀粉作為一種理想的緩釋材料，可吸附香料、甜味劑、酸性調(diào)味品、酶、調(diào)味劑等[6]。此外，一些材料如二十二碳六烯酸(DHA)、維生素A、胡蘿卜素和姜黃素等在大氣或光照下容易被氧化或分解，通過多孔淀粉吸附后可達(dá)到有效保護(hù)作用[7]。常用的多孔淀粉的制備方法包括化學(xué)法、生物法和物理法[8-10]。特別是酶法、超聲法等制備的多孔淀粉具有綠色環(huán)保、工藝方便、性質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點而備受青睞。然而，目前有關(guān)物理、生物方法復(fù)合制備多孔淀粉的研究還較少。特別是將大米淀粉采用超聲預(yù)處理后，以復(fù)合酶解的形式制備多孔淀粉的研究還鮮見報道。本研究以稻米企業(yè)加工過程中低附加值碎米所提取的淀粉為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助復(fù)合酶法制備多孔淀粉的最佳工藝條件，然后通過掃描電鏡(SEM)和X-晶體射線衍射(XRD)表征淀粉顆粒的微觀結(jié)構(gòu)及晶型結(jié)構(gòu)，通過傅里葉紅外光譜(FTIR)研究多孔淀粉的特征官能團(tuán)變化，以期為后續(xù)的碎米高值化利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

碎米：寧夏昊王集團(tuán)；碎米淀粉采用堿法進(jìn)行提取[11]；α-淀粉酶(BR)、糖化酶(液化型，10 U/mL)；NaOH、Na2HPO4、C6H7O8(均為分析純)；D-GLUCOSE Megazyme；元寶牌大豆油。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-3018R高速冷凍離心機(jī)；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；722N可見分光光度計；Gemini300掃描電子顯微鏡；XRD-7000衍射儀；NICOLET 6700紅外光譜分析儀。

1.3 方法

1.3.1 碎米多孔淀粉的制備

精確稱取10.0 g碎米淀粉，加入40 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)漿，超聲處理一段時間。加入 α-淀粉酶和糖化酶，在恒溫水浴鍋中溫和攪拌一定時間后，加入 4% 的NaOH溶液終止反應(yīng)。將懸浮液在8 000 r/min的條件下離心5 min，去除上清液，用蒸餾水洗滌沉淀3次。沉淀置于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥直至恒重，研磨過100目篩。

1.3.2 吸油率的測定

精確稱取烘干至恒重的淀粉0.50 g，記為m1，置于已知質(zhì)量的離心管中，記為m2，用移液槍量取5 mL大豆油與淀粉混勻后靜置30 min，在4 000 r/min的條件下離心20 min,將上層大豆油吸出，稱取離心管和淀粉的總質(zhì)量，記為m3[12]。按公式計算。

1.3.3 水解率的測定

根據(jù)武赟等[13]的方法略加修改，取淀粉水解后的上清液1.0 mL，加水稀釋200倍。再取稀釋后的上清液0.1 mL與3.0 mL GOPOD溶液于5 mL離心管中，對照組為0.1 mL D-GLucose標(biāo)準(zhǔn)品與3.0 mL GOPOD溶液，空白組為0.1 mL蒸餾水與3.0 mL GOPOD溶液，混合均勻后于45 ℃條件下預(yù)熱20 min，冷卻至室溫后在510 nm處測定吸光值。

×100

式中：C為D-Glucose質(zhì)量濃度/mg/mL；V為反應(yīng)體系中淀粉乳體積/mL；m為反應(yīng)前淀粉質(zhì)量/g；200為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素實驗

研究影響多孔淀粉吸附容量的反應(yīng)條件，包括超聲時間、超聲功率、酶促反應(yīng)溫度、反應(yīng)溶液的 pH、α-淀粉酶和糖化酶的質(zhì)量比(酶配比)、酶與淀粉的總量的質(zhì)量比(加酶量)和酶解時間7個因素，以吸油率和水解率為評價多孔淀粉制備效果優(yōu)劣的的指標(biāo)。初始實驗條件為：超聲時間30 min、超聲功率400 W、酶解溫度40 ℃、pH=4.0、α-淀粉酶∶糖化酶=1∶3、加酶量1.2%、酶解時間4 h,后續(xù)實驗依次將前因素的最優(yōu)值代入。

1.3.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以超聲時間、超聲功率、加酶量、酶解時間4個因素為自變量，以吸油率為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行實驗設(shè)計，因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken 設(shè)計因素水平

1.3.6 淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)表征

將原淀粉、超聲處理淀粉和多孔淀粉粉末分別涂覆在粘附有雙面膠帶的樣品架上，在真空狀態(tài)下，用金濺射涂布機(jī)給樣品涂覆一層薄薄的金層，在3 kV的加速電壓下，通過SEM觀察淀粉的形態(tài)特征[14]。

1.3.7 淀粉顆粒X-晶體射線衍射測定

根據(jù)Yang等[15]的方法略加修改，使用X射線衍射儀分析樣品的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。樣品于45 ℃烘箱中放置12 h。在40 kV和40 mA下用Cu-Kα輻射(K-Alpha1=1.540 598，K-Alpha2=1.544 426，K-Alpha2/ K-Alpha10.5)。發(fā)散狹縫固定為0.38 mm。掃描范圍為4°～40°(2θ)。使用Origin pro 9.1整合峰。計算相對結(jié)晶度(Xc)。

Xc=Ac/(Aa+Ac)×100%

式中：Ac和Aa分別為X射線衍射圖上的結(jié)晶區(qū)域和非晶區(qū)域。

1.3.8 傅里葉紅外光譜分析

天然淀粉、超聲處理淀粉和多孔淀粉的傅里葉變換紅外(FTIR)光譜在NICOLET 6700光譜儀上進(jìn)行測定。將2種樣品與固體KBr粉末混合，并將約40 mg該混合物用于制備粒料。將KBr顆粒干燥并進(jìn)行FTIR分光光度測定。以4 000～500 cm-1的波數(shù)記錄透射率。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 24.0軟件統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)，采用Origin pro 9.1和Design-Expert 8.0.6 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 多孔淀粉制備的單因素實驗結(jié)果

圖1為超聲時間、超聲功率、溫度、pH、酶配比、加酶量和酶解時間對多孔淀粉水解率和吸油率的影響。只進(jìn)行4 h酶解反應(yīng)的多孔淀粉的吸油率只有64%左右，而超聲預(yù)處理30 min再酶解相同時間的吸油率提高近10%。超聲作用破壞了淀粉顆粒表面的水束層，有利于復(fù)合酶對淀粉的水解[16]。此外也可能是超聲波導(dǎo)致淀粉一定程度的損傷或產(chǎn)生了孔隙，增大了酶-底物的界面面積，增加了二者的接觸機(jī)會[17]。隨著超聲時間的延長，吸油率降低，水解率持續(xù)增大。原因在于超聲時間過長，淀粉的損傷和孔隙變大，酶大量滲透到顆粒內(nèi)部，淀粉過度水解，多孔出現(xiàn)坍塌，從而導(dǎo)致吸附性下降[4]。

隨著超聲功率的增大,吸油率先增大后減小，水解率一直增大。這是因為超聲時會發(fā)生“空穴效應(yīng)”，產(chǎn)生的剪切力可切斷淀粉的長鏈，且超聲波產(chǎn)生的自由基會攻擊淀粉分子，導(dǎo)致α-1,4糖苷鍵斷裂，為酶水解淀粉提供了更多的結(jié)合位點[18]。

吸油率隨溫度的升高先增大后減小。當(dāng)溫度低時酶活性較低，隨著溫度的升高，酶活性增加使水解程度增大，吸附能力增加。水解率增加，可能是因為淀粉因膨脹而使吸附量降低，淀粉顆粒的無定形區(qū)域因溫度升高而受損，導(dǎo)致水解率顯著增加[19]。

圖1 不同影響因素對水解率和吸油率的影響

隨著pH的增大，水解率和吸油率都先增大后減小，在pH=4.0時均達(dá)到最大值。當(dāng)pH值改變時，酶的結(jié)構(gòu)和底物的電荷性質(zhì)可能會發(fā)生轉(zhuǎn)變，使得底物不能與活性位點結(jié)合或不能進(jìn)行催化[20]。

當(dāng)α-淀粉酶∶糖化酶達(dá)到1∶5時，水解率和吸油率都達(dá)到最大值。α-淀粉酶是一種內(nèi)切酶，可以隨機(jī)水解淀粉的α-1,4糖苷鍵，而糖化酶是一種外切酶，不僅可以水解α-1,4糖苷鍵，還可以水解 α-1,6糖苷鍵[19]。酶配比在1∶5時吸油率和水解率值最大，表明此時兩種酶協(xié)同效果最好。

當(dāng)酶總量的增加時，吸油率先增加后減小，而水解率一直在增加。酶用量較小時，淀粉中只形成了小而淺的孔，主要是表面吸附。進(jìn)一步增加酶量時，孔數(shù)量增多且孔洞增大，吸附容量增加，導(dǎo)致了水解率和吸油率的增大[10]。當(dāng)酶的添加量繼續(xù)增大時，大量的酶分子與底物結(jié)合，劇烈的水解破壞了淀粉的多孔結(jié)構(gòu)，使淀粉的吸附能力反而下降。

隨著酶解時間的增加，吸油率先增加后減小。這是因為在水解初期，隨著反應(yīng)時間的延長，孔隙量增加且變大變深，致其吸附量增加。當(dāng)水解時間超過16 h，淀粉顆粒的多孔結(jié)構(gòu)開始破碎并分解成許多小顆粒，小顆粒被水解后最終完全轉(zhuǎn)化為葡萄糖，這種過度水解破壞了淀粉的多孔結(jié)構(gòu)，因此淀粉的吸油率開始降低[21]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

結(jié)合單因素實驗結(jié)果及淀粉與油不相溶的特性，吸油率的測試誤差較小，可真實反映多孔淀粉的吸附能力[22]。因此吸油率更適合作為優(yōu)化指標(biāo)。以吸油率為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計并優(yōu)化參數(shù)。實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到二次多項回歸模型：

吸油率=97.53-2.75×A+5.84×B+2.90×C-4.36×D-1.11×AB+1.07×AC+1.88×AD+0.13×BC-1.50×BD+1.50×CD-1.70×A2-1.30×B2-1.30×C2-3.13×D2

響應(yīng)面結(jié)果的方差分析見表3。模型F值=4.57>0.05，P= 0.003 7<0.01，表明模型顯著。而且B、D的影響極顯著(P<0.01)，A、C的影響顯著(P<0.05)，對吸油率影響的先后順序是：超聲功率>酶解時間>加酶量>超聲時間。失擬項F值=2.52>0.05；P=0.193 8>0.05，表明未知因素對實驗結(jié)果的影響很小，模型擬合程度較好，實驗誤差較小，可以用此模型說明各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果

表3 吸油率回歸方程方差分析

注： *為差異顯著(P< 0.05)，**為差異極顯著(P<0.01)。

2.2.1 響應(yīng)面分析

由圖2可知，在選定的范圍內(nèi)，隨著超聲時間、超聲功率、加酶量和酶解時間的增加，響應(yīng)值吸油率都表現(xiàn)出了先增大后減小的趨勢。當(dāng)超聲功率和加酶量過大，酶解時間和超聲時間過長，碎米淀粉被充分水解，淀粉的孔隙結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)坍塌。對油的吸附性變差，導(dǎo)致吸油率降低。4個因素之間都有一定的交互作用，但是交互性不顯著(P>0.05)。從等值線可看出，各因素中心點附近的吸油率值都比較高，說明此條件下的多孔淀粉的吸附性能較好。

圖2 不同因素間交互作用的等值線圖

2.2.2 驗證實驗

用Design-Expert 軟件的響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果，對各實驗因子最優(yōu)化分析后，得到的吸油率預(yù)測值為106%，此時A、B、C、D的值分別為25 min、450 W、1.43%、14 h。根據(jù)實驗的實際可操作性，將優(yōu)化條件的值調(diào)整為25 min、450 W、1.4%、14 h。以最佳條件做3組平行驗證實驗，結(jié)果見表4。實際吸油率值為105.33%，與預(yù)測值接近。充分驗證了此模型的準(zhǔn)確性。

表4 驗證實驗結(jié)果

2.3 淀粉的表面形態(tài)觀察

圖3a是原碎米淀粉電鏡圖，天然淀粉表面光滑，呈不同銳度的不規(guī)則多邊形形狀。通過(450 W，25 min)超聲處理后得圖3b，發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒表面出現(xiàn)了皺褶、裂紋和零星幾個淺而小的凹陷的小坑，結(jié)果與Sujka等[23]的研究結(jié)果一致。而通過超聲預(yù)處理后再經(jīng) α-淀粉酶和糖化酶酶解后獲得了多孔淀粉圖3c，發(fā)現(xiàn)其中大多淀粉均形成了相對均勻、較大且較深的孔。

圖3 淀粉的掃描電鏡圖

圖4 原生淀粉、超聲淀粉和多孔淀粉的X-晶體射線衍射圖

2.4 X-晶體射線衍射分析

原生淀粉、超聲處理淀粉和多孔淀粉的衍射圖譜如圖4所示。原淀粉的衍射峰在約15°和23°處出現(xiàn)強(qiáng)烈的衍射峰，并且在2θ的17°和18°附近顯示出未解析的雙峰，表明其結(jié)晶型是A型。此結(jié)果與Jiang等[24]報道結(jié)果一致。超聲波處理淀粉和多孔淀粉都保持了A型結(jié)晶結(jié)構(gòu)，Li等[25]和Zhu等[26]報道過相似的結(jié)果。原淀粉的結(jié)晶度為(33.67±1.5)%，酶解淀粉的結(jié)晶度為(34.94±1.5)%，略高于原淀粉。這是因為在酶解過程中無定形淀粉比結(jié)晶淀粉更容易被消化。超聲處理淀粉結(jié)晶度為(31.08±1.5)%，略低于原淀粉。

2.5 傅里葉紅外光譜圖分析

圖5 原生淀粉、超聲淀粉和多孔淀粉的紅外光譜圖

3 結(jié)論

一定強(qiáng)度的超聲預(yù)處理有助于復(fù)合酶法制備多孔淀粉。超聲輔助酶法制備碎米多孔淀粉的最佳工藝條件為：超聲時間25 min，超聲功率450 W，溫度40 ℃、pH=4.0、酶配比1∶5(α-淀粉酶：糖化酶)、加酶量1.4%、酶解時間14 h，此條件下的吸油率為105.33%。因此，超聲輔助酶法是一種制備碎米多孔淀粉的高效方法。通過SEM觀察超聲波處理后的淀粉表面出現(xiàn)了皺褶、裂縫和凹陷，酶解后的的淀粉表面出現(xiàn)了多而深且較大的孔。XRD結(jié)果表明，原淀粉、超聲處理淀粉和多孔淀粉都是典型的A型結(jié)晶結(jié)構(gòu)，超聲處理和酶解并沒有改變淀粉的晶體類型；同時，F(xiàn)TIR圖譜表明這2種處理方式不會改變淀粉的化學(xué)結(jié)構(gòu)。