響應面法優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝

楊 潔 王海麗 趙三虎 范建鳳 趙二勞

(忻州師范學院化學系，忻州 034000)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld)又稱南美藜、藜谷等，營養(yǎng)豐富而獨特，被譽為“營養(yǎng)黃金”、“超級谷物”[1]。藜麥原產于南美洲安第斯山區(qū)[2]，我國1987年開始引種，現(xiàn)已在山西、陜西、青海和四川等地規(guī)模化種植[3,4]，資源較為豐富。藜麥中含有皂苷，且藜麥麩皮中皂苷含量更高[5,6]，藜麥皂苷具有清除自由基的抗氧化活性[7，8]。因此，研究藜麥麩皮皂苷的提取及有效提高其抗氧化活性的方法，對于藜麥麩皮皂苷的精深開發(fā)應用具有重要的實際意義。

目前，有關藜麥皂苷的研究較多，且主要集中于提取純化工藝及其生物活性上，如黃金等[9]研究了藜麥籽粒皂苷乙醇浸提工藝；梁霞等[10]研究了藜麥總皂苷的乙醇回流提取工藝；趙亞東等[9]研究了青海藜麥中皂苷超聲輔助乙醇提取及其抗氧化活性；楊潔等[7]研究了藜麥皮皂苷的微波輔助提取及其抗氧化活性；趙文婷[11]研究了藜麥麩皮總皂苷乙醇回流提取及其抗氧化和免疫增強作用；而嵇麗紅等[12]則研究了不同水解方法對藜麥皂苷抑菌活性及酪氨酸酶抑制作用的影響。但有關藜麥麩皮皂苷酸水解對抗氧化活性的影響研究鮮見報道。基于此，本研究以DPPH·清除率為指標，鹽酸濃度、液液比、水解溫度和水解時間為因素，采用響應面法優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝，并比較藜麥皂苷酸水解前后清除DPPH·能力及抗氧化活性，為藜麥皂苷用于抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥麩皮：山西華青藜麥產品開發(fā)有限公司。以石油醚脫脂，烘箱中60 ℃烘干，粉碎過60目篩，裝瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)標準品；鹽酸、氫氧化鈉、氨水和無水乙醇等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

V-1100D型可見分光光度計； PHS-3C型智能酸度計；LWMC-201型電腦微波化學反應器。

1.3 方法

1.3.1 藜麥皂苷提取液的制備

采用微波輔助提取藜麥麩皮中的皂苷[7]。準確稱取5.0 g藜麥麩皮置于250 mL圓底燒瓶中，加入150 mL體積分數(shù)68%的乙醇溶液，微波功率455 W，微波時間10 min，提取3次，合并提取液，旋轉蒸發(fā)儀濃縮至100 mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 對DPPH·清除率的測定

藜麥麩皮皂苷及其水解液對DPPH·清除率的測定參考文獻的方法進行[7,13,14]。量取1.0 mL質量濃度為 0.1 mg/mL的DPPH溶液于比色管中，再加入待測液0.2 mL，用68%無水乙醇定容至5 mL，搖勻，室溫下避光反應30 min后，在最大波長517 nm處測量其吸光度值為A1；測定不加待測液僅DPPH溶液吸光度為A0；測定不加DPPH溶液僅待測溶液的吸光度為A2。藜麥麩皮皂苷及其水解液對DPPH·清除率按公式計算。

1.3.3 藜麥麩皮皂苷酸水解工藝流程

藜麥麩皮皂苷提取液→加鹽酸→恒溫水解→水解液冷卻→調pH→定容→測定

主要技術參數(shù)：藜麥麩皮皂苷提取液2.5 mL，水解液水浴冷卻至室溫，氨水調水解液pH為中性，定容體積25 mL，測定體積0.2 mL，其余按實驗設計。

1.3.4 藜麥麩皮皂苷酸水解單因素實驗

鹽酸濃度對藜麥麩皮皂苷酸水解的影響：液液比1∶3(mL/mL)，水解溫度70 ℃，分別在鹽酸濃度為1.2、2.5、4.8、6.6、8.4 mol/L條件下水解1.0 h，以藜麥麩皮皂苷水解液對DPPH·清除率為指標，確定最適藜麥麩皮皂苷酸水解的鹽酸濃度。

液液比對藜麥麩皮皂苷酸水解的影響：水解溫度70 ℃，鹽酸濃度4.8 mol/L，分別在液液比為1∶1.8、1∶2.4、1∶3、1∶3.6、1∶4.2(mL/mL)的條件下水解1.0 h，以藜麥麩皮皂苷水解液對DPPH·清除率為指標，確定最適藜麥麩皮皂苷酸水解的液液比。

水解溫度對藜麥麩皮皂苷酸水解的影響：液液比為1∶3(mL/mL)，鹽酸濃度4.8 mol/L，分別在水解溫度為50、60、70、80、90 ℃的條件下水解1.0 h，以藜麥麩皮皂苷水解液對DPPH·清除率為指標，確定最適藜麥麩皮皂苷酸水解的水解溫度。

水解時間對藜麥麩皮皂苷酸水解的影響：在液液比1∶3(mL/mL)，水解溫度70 ℃，鹽酸濃度4.8 mol/L的條件下，分別水解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，以藜麥麩皮皂苷水解液對DPPH·清除率為指標，確定最適藜麥麩皮皂苷酸水解的水解時間。

1.3.5 響應面法優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝

根據單因素實驗結果，以鹽酸濃度(A)、液液比(B)、水解溫度(C)、水解時間(D)為自變量，藜麥皂苷水解液對DPPH·清除率為響應值(Y)，采用Box-Behnken設計實驗，由模型分析實驗結果，確定最佳水解工藝條件。響應面設計因素與水平如表1所示。

表1 響應面設計因素與水平

1.3.6 藜麥麩皮皂苷酸水解產物推測

采用薄層色譜法進行藜麥麩皮皂苷酸水解產物推測[15，16]。實驗所用的正相展開劑為三氯甲烷∶甲醇=6∶1，反相展開劑為甲醇∶水=2.7∶1，顯色劑為濃硫酸∶無水乙醇=1∶9。

1.3.7 數(shù)據處理

指標數(shù)據均為3次平行測定值，作圖采用Origin 8.0軟件，數(shù)據分析采用SPSS軟件進行，P<0.01為差異極顯著；P<0.05為差異顯著；P>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

圖1 皂苷酸水解單因素實驗

各因素對藜麥麩皮皂苷酸水解影響結果見圖1。隨著水解鹽酸濃度的增加，皂苷水解液對DPPH·的清除率先增后減，當鹽酸濃度為6.6 mol/L時，皂苷水解液對DPPH·的清除率最高，為50.43%。當鹽酸濃度低于6.6 mol/L時，增加鹽酸濃度有利于皂苷糖鏈的斷裂，產生系列相應的次級皂苷或者皂苷元，使水解液清除DPPH·的能力升高；當鹽酸濃度大于6.6 mol/L后，可能由于溶液中氯離子濃度偏高，使水解成的部分皂苷元轉化為羥基氯代物，導致水解液清除DPPH·的活性降低[17]。因此選擇鹽酸濃度為6.6 mol/L為最適工藝條件。

隨著液液比的增加，皂苷水解液對DPPH·的清除率先增大后減小。當液液比小于1∶2.4(mL/mL)時，隨著液液比中鹽酸量的增加，從而使皂苷酸水解程度增加，皂苷水解液清除DPPH·能力增強；當液液比為1∶2.4(mL/mL)時，皂苷水解液DPPH·清除率最大。當液液比大于1∶2.4(mL/mL)，皂苷水解液清除DPPH·能力降低，其原因可能是水解液中存在的蛋白、淀粉等雜質影響水解進行[17,18]，抑制了皂苷水解，導致皂苷水解液清除DPPH·能力減弱。因此，選擇液液比1∶2.4(mL/mL)為最適工藝條件。

隨著水解溫度的升高，皂苷水解液對DPPH·的清除率先增后減，在水解溫度為80 ℃時，皂苷水解液對DPPH·的清除率達到最大，為57.0%。當水解溫度小于80 ℃時，隨水解溫度的升高，分子熱運動加劇，單位體積內皂苷分子與鹽酸分子相互碰撞的機會增多，促進了皂苷水解反應的發(fā)生，皂苷水解液對DPPH·的清除率增大；當水解溫度大于80 ℃時，可能由于溫度過高，水解產物中皂苷元等發(fā)生轉化，減少皂苷元類物質的生成[18]，導致水解液對DPPH·的清除率降低，因此選擇水解溫度80 ℃為最適工藝條件。

水解初期反應進行較快，隨著水解時間增加，皂苷水解液對DPPH·的清除率逐漸增加，當水解時間為2.0 h時，皂苷水解液對DPPH·的清除率達到最大，為59.83%。當水解時間大于2.0 h后，再延長水解時間，皂苷水解液對DPPH·的清除率降低。其原因可能是水解初期，隨時間增加，皂苷與鹽酸分子接觸時間增長，使得水解逐漸趨于完全，水解液中皂苷元等增加，水解液對DPPH·的清除率增加；當水解時間大于2.0 h后，可能由于水解時間過長，產生的皂苷元部分發(fā)生脫水、環(huán)合、雙鍵移位、取代基移位、構型轉化等結構發(fā)生變化[19]，使得皂苷水解液對DPPH·的清除率降低。因此選擇水解時間2.0 h為最適工藝條件。

2.2 響應面優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝

2.2.1 響應面實驗設計及結果

根據單因素實驗，以水解液對DPPH·的清除率為響應值(Y)，鹽酸濃度(A)、液液比(B)、水解溫度(C)和水解時間(D)為因素，按Box-Behnken設計實驗，進行四因素三水平的響應面實驗，優(yōu)化藜麥麩皮皂苷酸水解工藝，實驗設計及結果見表2。

2.2.2 響應面回歸模型及方差分析

利用Design-Expert V8.0.6軟件對表2響應面

表2 響應面實驗設計及結果

實驗結果進行多元回歸擬合和方差分析。擬合的二次多項回歸模型方程為：Y=0.64+0.01A+3.450×10-0.03B+0.016C+0.035D-0.011AB-0.019AC-0.047AD+6.875×10-0.03BC-0.020BD-0.019CD-6.708×10-0.03A2-6.008×10-0.03B2-0.052C2-0.015D2，從回歸方程系數(shù)可以看出，各因素對響應值影響的大小順序為：D(水解時間)>C(水解溫度)>A(鹽酸濃度)>B(液液比)。對回歸模型的方差分析結果見表3。

由表3方差分析可知，實驗擬合的二次多項回歸模型具有高度的顯著性(P<0.000 1)，模型失擬項P=0.430 2>0.05，不顯著，說明建模成功，實驗結果可用該模型描述。模型的決定系數(shù)R2=0.974 7，說明響應值的變化有97.47%來源于所選因素，該模型與實際情況接近，實驗擬合程度良好，實驗誤差小，能充分反映各因素與響應值間的關系。變異系數(shù)CV=1.6%<5%，說明模型的置信度較高，重現(xiàn)性較好，實驗設計合理。因此可以用該模型對實驗結果進行分析和預測。由表3還可看出，鹽酸濃度、水解溫度和水解時間的一次項，水解溫度和水解時間的二次項，以及鹽酸濃度與水解溫度、鹽酸濃度與水解時間、液液比與水解時間、水解溫度與水解時間的交互項對響應值的影響都達到極顯著水平(P<0.01)，鹽酸濃度與液液比的交互項對響應值的影響達到顯著水平(P<0.05)，說明各因素對響應值的影響較為復雜，不是簡單的線性關系，而應是拋物面關系。由表3中各因素F值的大小可知，各因素對藜麥麩皮皂苷酸水解物清除DPPH·能力影響的大小順序為：水解時間> 水解溫度> 鹽酸濃度> 液液比，這與利用模型方程系數(shù)分析的結果一致。

表3 回歸模型方差分析

注：*差異顯著，P<0.05；**差異極顯著，P<0.01。

2.2.3 因素間交互作用分析

根據回歸方程得出不同因子交互作用的響應面分析圖以及等值線圖如圖2～圖7所示。

觀察各因素間交互作用的響應面圖形，若響應曲面坡度越彎曲，則響應值對于因素的改變越敏感，相反曲面越平緩，則響應值對于因素的改變越遲鈍[20]；等高線圖的形狀可反映交互作用的強弱，等高線圖形越橢圓，表示交互作用越顯著[21]。從圖2～圖7可以直觀地看出，AC、AD、BD、CD即鹽酸濃度與水解溫度、鹽酸濃度與水解時間、液液比與水解時間、水解溫度與水解時間的交互項對響應值的影響顯著，這與模型的方差分析結果一致。

圖2 鹽酸濃度與液液比交互作用的響應面圖與等高線圖

圖3 鹽酸濃度與水解溫度交互作用的響應面圖與等高線圖

圖4 鹽酸濃度與水解時間交互作用的響應面圖與等高線圖

圖5 液液比與水解溫度交互作用的響應面圖與等高線圖

2.2.4 最佳工藝條件與驗證

根據擬合模型方程得到藜麥麩皮皂苷酸水解的最優(yōu)條件為：鹽酸濃度4.85 mol/L，液液比1∶1.91(mL/mL)，水解溫度為80.52 ℃，水解時間為2.49 h。根據實驗操作的具體情況，各參數(shù)調整為：鹽酸濃度

圖6 液液比與水解時間交互作用的響應面圖與等高線圖

圖7 水解溫度與水解時間相互影響的響應面圖與等高線圖

4.8 mol/L，液液比1∶2(mL/mL)，水解溫度80 ℃，水解時間2.5 h。在此工藝條件下，進行5次平行驗證實驗，取其平均值，得到藜麥麩皮皂苷水解物對DPPH·的清除率為68.84%，由回歸方程計算得藜麥麩皮皂苷水解物對DPPH·的理論清除率為69.14%，與理論預測值的相對誤差為0.43%，表明結果可靠，驗證了擬合模型的可行性。

2.3 DPPH·清除率比較

在藜麥麩皮皂苷相同濃度下，比較酸水解前后皂苷液對DPPH·的清除率，5次平行實驗測得水解前皂苷液對DPPH·的清除率平均為22.8%，水解后皂苷液對DPPH·清除率平均為68.8%，顯著檢驗表明，水解前后皂苷液對DPPH·清除率存在極顯著差異(P<0.01)，藜麥麩皮皂苷經酸水解后其清除DPPH·的能力及抗氧化活性極顯著提高。酸水解可有效提高藜麥麩皮皂苷清除自由基及抗氧化活性。

2.4 藜麥皂苷酸水解產物推測

對藜麥麩皮皂苷酸水解產物進行薄層色譜分析，結果如圖8所示。藜麥麩皮皂苷水解后產物在正相薄層色譜板(圖8a中A)上方、反相薄層色譜板(圖8b中A)下方，表明水解產物極性相對水解前皂苷極性更小。另外，比較圖8中A與C可發(fā)現(xiàn)，藜麥麩皮皂苷經過酸水解后，產物的極性介于苷元(齊墩果酸)和2個雙糖及2個三糖基皂苷之間。表明經酸水解后，藜麥麩皮皂苷可能生成了極性較小的單糖苷或者其他苷元。推測這些極性更小的次級皂苷以及皂苷元清除DPPH·的能力即抗氧化能力強于藜麥皂苷，導致藜麥麩皮皂苷酸水解后抗氧化活性增強。

注：A：皂苷酸水解后；B：皂苷酸水解前；C：5種皂苷類單體(齊墩果酸、3-O[-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤苷元]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖美商陸酸]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-[β-D- glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-吡喃阿拉伯糖美商陸酸]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-[β-D-glucopyranosyl- (1→3)-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤苷元]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)。

圖8薄層色譜圖

3 結論

以DPPH·清除率為指標，在單因素實驗的基礎上，以鹽酸濃度、液液比、水解溫度和水解時間為因素，采用響應面法優(yōu)化了藜麥麩皮皂苷酸水解工藝。結果表明，影響藜麥麩皮皂苷酸水解的因素大小順序為：水解時間> 水解溫度> 鹽酸濃度> 液液比，優(yōu)化的藜麥麩皮皂苷酸水解最佳工藝條件：鹽酸濃度4.8 mol/L，液液比1∶2(mL/mL)，水解溫度80 ℃，水解時間2.5 h。在該工藝條件下，藜麥麩皮皂苷酸水解物對DPPH·清除率顯著高于酸水解DPPH·清除率。表明酸水解可有效提高藜麥麩皮皂苷清除自由基抗氧化活性。但本實驗僅對藜麥麩皮皂苷酸水解后可有效提高清除DPPH·能力進行了研究，而有關藜麥麩皮皂苷酸水解產物為何種皂苷元，以及何種皂苷元起到清除自由基的抗氧化作用還有待深入研究。