超高壓法提取藜麥皂苷的工藝研究

王志娟 張 煒 田 格 辛小麗 甘文梅 高 紅 乜世成

(青海師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，西寧 810008)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld L.)是一種有著5 000～7 000年種植歷史的藜科雙子葉植物[1]，不同品種的種子顏色各異[2]。它不僅存在著多種活性成分，還富含各類營養(yǎng)物質(zhì)，因此它具有多種保健功能，被譽為“超級谷物”[3]。

藜麥皂苷由三萜皂苷β-香草素衍生而來，通過異戊二烯途徑生成，主要為齊墩果酸型、常春藤型、商陸酸型等，其中齊墩果酸型含量最高[4，5]。藜麥皂苷主要存在于種皮中，其含量在 0.14%～2.30%[6]，具有抗菌、抗氧化、降血糖等多種功效[7，8]，因此藜麥皂苷被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和保健行業(yè)。皂苷具有苦澀味，這將會影響藜麥的口感[9]，在食用前需將種皮除去，因此在藜麥的生產(chǎn)過程中，大量堆積的藜麥種皮粉不僅會對環(huán)境造成嚴重影響，若將藜麥種皮粉直接丟棄，會浪費資源。本實驗將藜麥種皮作為原料，減少了其對環(huán)境的污染，實現(xiàn)了資源的再利用和可持續(xù)發(fā)展[10]。

目前，皂苷的提取方法主要有回流法、超聲波輔助法[11]、微波輔助法[12]、酶提取法[13]、超臨界萃取法[14]等。但這些方法存在提取率低、提取時間長、工藝流程復(fù)雜、溶劑用量大等不足[15]，超高壓提取技術(shù)[16]，與上述方法相比，具有提取率高、耗時短、工藝流程簡單且綠色環(huán)保等優(yōu)點[6-8]，已逐漸被用于提取植物中活性成分[17]。本實驗將藜麥種皮作為提取原料，皂苷含量作為評價指標(biāo)，通過單因素實驗及Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實驗，確定出最佳提取條件，為提取藜麥中的皂苷提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥種皮：青海三江沃土生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司(青海省食品檢驗檢測院束彤研究員鑒定)；乙醇(AR)、香草醛(AR)、冰醋酸(AR)、高氯酸(AR)；齊墩果酸標(biāo)準品。

GX-04多功能粉碎機；101A-1E 電熱鼓風(fēng)干燥箱；HPP 600 MPa/5 L超高壓食品處理裝置；TU-1901 雙光束紫外-可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥種皮的預(yù)處理

將藜麥種皮用多功能粉碎機粉碎后，過80目篩，置于50 ℃烘箱中干燥至恒重，備用。

1.2.2 藜麥皂苷的超高壓提取

將預(yù)處理過的藜麥種皮粉按照一定的料液比與不同體積分數(shù)的乙醇溶液裝在耐壓、柔韌性好、能傳遞壓力且密閉性好的塑料小瓶內(nèi)，混合均勻，放入高壓容器中，設(shè)定所需時間與壓力后，在連動模式下，啟動高壓泵，待增壓及卸壓過程完成后，取出反應(yīng)容器中的塑料小瓶，將料液進行減壓抽濾操作，備用。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取時間對藜麥皂苷含量的影響

將0.500 0 g藜麥種皮粉于壓力為300 MPa，乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1∶150 g/mL條件下進行超高壓操作，考察提取時間在3、6、9、12、15 min時對皂苷含量的影響。

1.2.3.2 提取壓力對藜麥皂苷含量的影響

將0.500 0 g藜麥種皮粉于提取時間為9 min，乙醇體積分數(shù)為60%，料液比為1∶150條件下進行超高壓操作，考察提取壓力在150、200、250、300、350 MPa時對皂苷含量的影響。

1.2.3.3 乙醇體積分數(shù)對藜麥皂苷含量的影響

將0.500 0 g藜麥種皮粉于提取時間為9 min，壓力為300 MPa，料液比為1∶150條件下進行超高壓操作，考察乙醇體積分數(shù)在50%、60%、70%、80%、90%時對皂苷含量的影響。

1.2.3.4 料液比對藜麥皂苷含量的影響

控制提取時間為9 min，壓力為300 MPa，乙醇體積分數(shù)為60%，考察料液比為1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250 g/mL時對皂苷含量的影響。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計方案，以超高壓提取時間(A)、超高壓提取壓力(B)、乙醇體積分數(shù)(C)、料液比(D)為因素，皂苷含量為指標(biāo)。因素與水平的選擇見表1。

表1 藜麥皂苷響應(yīng)面因素水平設(shè)計表

1.2.5 香草醛-冰醋酸溶液的配制及齊墩果酸標(biāo)準曲線的繪制

用冰醋酸將5.000 0 g香草醛溶解并定容于100.00 mL容量瓶，搖勻，備用[18]。藜麥皂苷的主要存在形式是齊墩果酸型的三萜皂苷，因此將齊墩果酸作為標(biāo)準品，用香草醛-高氯酸法對皂苷濃度進行測定[19，20]。標(biāo)準曲線方程為：A=0.049 04ρ-0.011 41，R2=0.999 4。

1.2.6 藜麥皂苷含量的計算

皂苷含量(mg/g)=m1/m2

式中：m1為提取所得皂苷質(zhì)量/mg；m2為所稱藜麥種皮質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對藜麥皂苷含量的影響

如圖1所示，提取時間在3～9 min內(nèi)，皂苷含量隨時間的增加而提高。皂苷含量在9 min后逐漸降低，可能是由于提取時間過長，細胞內(nèi)其他物質(zhì)的溶出阻礙了皂苷的溶出通道[21]。當(dāng)提取時間為9 min時，皂苷含量達到最大值40.51 mg/g，因而選取提取時間范圍為6～12 min。

2.1.2 提取壓力對藜麥皂苷含量的影響

如圖1所示，皂苷含量在150 ～300 MPa不斷提高，可能是由于壓力的增大有利于細胞內(nèi)外壓力差的提高，從而加快了溶劑浸潤到種皮細胞內(nèi)部的速率。當(dāng)壓力高于300 MPa時，可能是由于壓力過大，細胞結(jié)構(gòu)趨于緊密，阻塞皂苷溶出通道，不利于皂苷的溶出，皂苷含量下降[22]。當(dāng)提取壓力為300 MPa時，皂苷含量達到最大值44.46 mg/g，因而選取提取壓力范圍為250～350 MPa。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對藜麥皂苷含量的影響

如圖1所示，皂苷含量隨乙醇體積分數(shù)的增大而降低。皂苷多溶于水和低濃度乙醇中[23]，較高濃度的乙醇水溶液使皂苷溶解度下降；較高濃度的乙醇水溶液也可能使細胞中的蛋白質(zhì)變性凝固堵塞組織微孔，阻礙皂苷的溶出[24]。當(dāng)乙醇體積分數(shù)為60%時，皂苷含量達到最大值48.61 mg/g，因而選取乙醇體積分數(shù)范圍為50%～70%。

2.1.4 料液比對藜麥皂苷含量的影響

如圖1所示，當(dāng)料液比為1∶50～1∶150 g/mL時，隨著料液比的增大，皂苷含量不斷升高，濃度梯度變大，皂苷從組織向外擴散的傳質(zhì)動力增大，有利于皂苷的溶出。用溶劑提取固體顆粒中有效成分時，溶質(zhì)通過多孔固體的擴散可以用有效擴散系數(shù)來描述，有效擴散系數(shù)與Fick定律有關(guān)，固液比越大越有利于有效成分的溶出[25]，但當(dāng)料液比為1∶150～1∶150 g/mL時，有效成分在溶液中的濃度過低，皂苷含量降低。當(dāng)料液比為1∶150時，皂苷含量達到最大值46.34 mg/g，因而選取料液比范圍為1∶100～1∶200。

圖1不同單因素對藜麥皂苷含量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面實驗設(shè)計和結(jié)果

選取超高壓提取時間(A)、超高壓提取壓力(B)、乙醇體積分數(shù)(C)、料液比(D)進行四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計，響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2回歸模型的建立與檢驗

對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得回歸方程：皂苷含量 =+76.13-2.47A-1.00B+3.50C+3.92D+0.66AB+0.44AC-1.08AD+0.18BC-0.020BD+2.39CD-5.65A2-4.71B2-7.67C2-7.83D2。對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表 3。

表3 方差分析結(jié)果

注：“**”表示極顯著(P<0.01)；“*”表示顯著(0.010.1)。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析及最佳工藝條件的確定

兩因素的交互作用見圖2。等高線的形狀反映了各因素之間交互效應(yīng)的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。由表3的顯著性分析及等高線圖可知，乙醇體積分數(shù)和料液比(CD)的交互作用對藜麥皂苷的提取影響極顯著。根據(jù)圖2結(jié)果，將Design-Expert 8.0.6軟件應(yīng)用于藜麥皂苷提取條件的優(yōu)化，得出最佳工藝條件：超高壓提取時間為8.27 min，超高壓提取壓力為294.03 MPa，乙醇體積分數(shù)為62.68%，料液比為1∶162，皂苷含量預(yù)測值為77.57 mg/g。

圖2響應(yīng)曲面3D圖

為驗證預(yù)測模型的可靠性，從實際情況出發(fā)，將最佳工藝條件進行調(diào)整：超高壓提取時間為8.27 min，超高壓提取壓力為294 MPa，乙醇體積分數(shù)為62%，料液比為1∶162。在此條件下，藜麥皂苷含量為(78.12±1.03) mg/g，接近其預(yù)測值，說明由Design-Expert 8.0.6設(shè)計軟件得到的最佳工藝條件可行。馮煥琴等[26]研究表明在60 ℃，乙醇體積分數(shù)為90%，料液比為1∶15 g/mL，超聲提取為1 h條件下藜麥種子中皂苷含量為5.06 mg/g。楊潔等[27]研究表明在乙醇體積分數(shù)為68%，微波功率為455 W，料液比為1∶32 g/mL，微波時間為10 min， 提取次數(shù)2次條件下藜麥皮總皂苷含量為26.329 mg/g。經(jīng)對比說明，超高壓提取技術(shù)具有操作簡單、耗時短、提取含量高等優(yōu)點。

3 結(jié)論

本實驗采用超高壓提取技術(shù)提取藜麥皂苷，在提取時間為8.27 min，提取壓力為294 MPa，乙醇體積分數(shù)為62%，料液比為1∶162條件下皂苷含量達78.12 mg/g。相較于溶劑提取法、超聲提取法、微波輔助法等，超高壓提取技術(shù)具有操作簡單、提取時間短、提取含量高等優(yōu)點，因此，超高壓提取技術(shù)是用于提取藜麥皂苷的一種簡單有效的方法，為藜麥皂苷的提取提供了新思路。